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1. 2 Disciplina: Seminário I Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura Professor: Dr. Ednardo Rodrigues.

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2 2 Disciplina: Seminário I Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA

3 3 Abordagem Proteômica e a Identificação de Biomarcadores de Processos Fisiológicos Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA

4 4 INTRODUÇÃO Proteínas Estrutural Transporte Enzimática Hormonal Imunológica Seres vivos

5 5 INTRODUÇÃO Anderson & Anderson (1982) ATLAS DAS PROTEÍNAS HUMANAS

6 6 A identificação e caracterização de proteínas, constituintes de uma matriz biológica (organismo, célula, organela, fluído biológico) que são produzidas em um determinado momento e sob determinadas condições. Proteômica ou Proteoma (Wasinger et al. 1995)

7 7 Degradações Proteínas DNA Transcrição pré-RNAm Splicing RNAm Tradução Modificações Fatores epigenéticos Temperatura Estresse Doenças Alimentação Dinâmica do proteoma WITZMANN & LI (2002)

8 8 OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA Proteômica Nível de expressão de proteínas Modificações Pós- traducionais Interações entre proteínas Identificação de Biomarcadores

9 9 BIOMARCADORES São moléculas biológicas indicadoras de estados fisiológicos ou patológicos, passíveis de serem mensuradas em células e fluídos biológicos. Moore et al., (2007)

10 10 ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Amostra Separação Identificação ZHOU et al., (2005) Coleta

11 11 Coleta de amostras: –Unicelulares (+ sincronização): fase do ciclo celular e condições de cultivo –Células e Tecidos de Organismos Pluricelulares (- sincronização): Biópsias: tipos celulares Cultura de tecidos –Coleta: Manual X microdissecção a laser –Fluídos biológicos Complexidade ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES

12 12 Eletroforese Bidimensional (2D) Espectrometria de Massa (EM) –Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos; Quantitativos Qualitativos Cromatografia líquida (CL) Espectrometria de massa (EM) –Recuperação de ptns na forma nativa Análises funcionais, estruturais e bioquímicas ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES

13 13 Separação de misturas proteícas com base em dois parâmetros físico-químicos: ponto isoelétrico (pI) e a massa molecular (M.M.), sob a influência de um campo elétrico: –1ª Etapa: Focalização Isoelétrica pI –2ª Etapa: Eletroforese descontínua em gel de poliacrilamida + SDS (SDS-PAGE) Tamanho (massa molecular) OFarrell, 1975; Gorg et al ELETROFORESE BIDIMENSIONAL

14 14 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (+) (-) pI (menor) M.M. SDS-PAGEFocalização Isoelétrica (maior)

15 15 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (menor) M.M. SDS-PAGE (maior)

16 16 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (+) (-) M.M. Revelação Azul brilhante de Coomassie coloidal Fluorescência pI (+)(-) Análise do gel

17 17 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL controle Tratamento Gel A Gel B ISSAQ & VEENSTRA (2008)

18 18 ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL EM GEL 2D (DIGE) controle Tratamento Cy5 UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008)

19 19 Tabela 1. Vantagens e limitações da eletroforese bidimensional. VantagensLimitações Quantificar expressãoReprodutibilidade Analisar modificações pós- traducionais Tempo de execução Avaliar várias proteínas Não é automatizada Proteínas de membrana Proteínas: pI e MM extremas

20 20 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E ESPECTROMETRIA DE MASSA Digestão: tripsina Espectrômetro de massas m/z Espectros de massas Programas: identificar a proteína

21 21 Técnica analítica que identifica a composição química de compostos, pela determinação de suas massas moleculares na forma iônica, baseada na sua movimentação (m/z) através de um campo elétrico ou magnético. ESPECTROMETRIA DE MASSAS Fonte de Ionização AnalisadorDetector Recipiente com baixa pressão Amostra Dados

22 22 ESPECTROMETRIA DE MASSA Ionização por dessorção a laser assistida por matriz -Tempo de vôo (MALDI-TOF) Tempo de vôoDetector Laser amostra Karas & Hillkamp (1998)

23 23 ESPECTROMETRIA DE MASSA m/z Espectros de massas peptídeos Programas de Análise e pesquisa em banco de dados. Impressão Digital de peptídeos Proteína Biomarcador Espectrômetro de massa

24 24 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Método de separação física baseado na migração diferencial de compostos, devido a suas distintas interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel (bombeada sob pressão) e a fase estacionária (pequenas partículas). peptídeos

25 25 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Fase líquida: Solvente: alto grau de pureza Fase estacionária: Troca iônica Altamente carregada (íons + ou -) Exclusão molecular Poros com tamanhos controlados MATT et al. 2008

26 26 SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Reservatório fase móvel Bomba de alta pressão Registro e análise dos dados Detector amostra coletor

27 27 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Métodos de detecção: –Absorbância (UV) –Fluorescência –Espectrometria de massa CL EM proteínas

28 28 CROMATOGRAFIA ASSOCIADA A ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM (ES/ES) Ionização por spray de elétrons –Tempo de vôo em TANDEM (ESI-TOF/TOF) m/z Camara de colisão MATT et al., 2008

29 29 ESPECTROMETRIA DE MASSA (EM/EM) m/z Espectros de massas Programas de Análise e pesquisa em banco de dados. Sequenciamento de novo da proteína Proteína Biomarcador Espectrômetro de massa (EM/EM)

30 30 Tabela 1. Vantagens e limitações da cromatografia líquida de alta performance. VantagensLimitações Tempo de execuçãoCusto do equipamento AutomatizaçãoManutenção do equipamento Versatilidade

31 31 ABORDAGEM PROTEÔMICA E IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Do geral para o particular Analisar proteomas de condições distintas e identificar as diferenças Do particular para o geral Analisar uma proteína e inferir suas funções no contexto do todo Separação de proteínas nas amostras Eletroforese bidimensionalCromatografia líquida (LC) fragmentação Espectrometria de Massas: Determinação de massas para identificação Impressão digital de peptídeosSequenciamento de novo Bioinformática PROTEINA MANN et al. 2001

32 32 Identificação da bactenecina no muco cervico-vaginal pela eletroforese-2D em um modelo ovino de trabalho de parto Indução de parto Dexametasona MS/MS (+) Bactenecina YOUNG et al. (2007) 0 h28 h Trabalho de parto

33 33 Análise proteômica de proteínas hipotalâmicas de linhagens de galinhas de alta e baixa produção de ovos corte poedeira 18 semanas 60 semanas CLAP- MS/MS Ribonucleoproteína nuclear heterôgenea H3 (HNRPH3) KUO et al. (2007) (HNRPH3) (+)

34 34 Proteína Osteopontina como biomarcador de fertilidade em bovinos Alta fertilidade Baixa fertilidade Purificação Sequenciamento identificação Osteopontina KILLIAN et al. (1993) 55 kDa; pI = 6,2 AIDA et al. (1999) GONÇALVES et al. (2008) sêmen oócitos FIV (+)

35 35 Desafios na Abordagem Proteômica e Identificação Biomarcadores Otimização dos bancos de dados Detecção de proteínas em baixas concentrações; Automatização das técnicas;

36 36 Perspectivas da abordagem proteômica e identificação de Biomarcadores Diagnóstico e prognóstico de doenças e animais humanas e animais; Seleção de animais de produção; Descoberta de novos princípios da fisiologia celular; Metabolômica;

37 37 Rodrigo V. De Oliveira


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