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METODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTEN Instituto Adolfo Lutz Divisão de Bromatologia e Química Serviço de Alimentos Seção de Doces e Amiláceos Rejane Weissheimer.

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1 METODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTEN Instituto Adolfo Lutz Divisão de Bromatologia e Química Serviço de Alimentos Seção de Doces e Amiláceos Rejane Weissheimer de Abreu

2 RWA Por que da ADVERTÊNCIA nos rótulos dos alimentos, em relação à presença ou ausência de glúten

3 DOENÇA CELÍACA TRATAMENTO Intolerância às proteínas provenientes do trigo, centeio, aveia e cevada PROLAMINAS Frações proteícas solúveis em álcool Alimentação totalmente isenta de glúten proteína do trigo = Glúten = glutenina + gliadina Pro-Ser-Gln-Gln-Pro RWA

4 LEGISLAÇÃO Lei Federal nº 8543/1992 Determinou a impressão de advertência em rótulos e embalagens de alimentos industrializados que contenham glúten ou apresentem em sua composição trigo, centeio, malte, cevada, aveia e/ou seus derivados. Resolução RDC nº 40/2002 Estendeu a obrigatoriedade da advertência CONTÉM GLÚTEN em caracteres com destaque, nítidos e de fácil leitura também as bebidas embaladas. Lei nº /2003 Obriga as inscrições CONTÉM GLÚTEN ou NÃO CONTÉM GLÚTEN para os produtos alimentícios comercializados, como medida preventiva e de controle da doença celíaca.

5 RWA IMPLANTAÇÃO Implantação de métodos analíticos sensíveis e específicos para detecção de glúten em alimentos. Testes Imunológicos Parceria BQ e BM Projeto FAPESP Objetivo: desenvolver metodologia Comparação ELISA in house x kit comercial ω gliadina

6 RWA ELISA

7 RWA Equipamentos básicos: balança, pHmetro, agitador de tubos (PHOENIS), agitador orbital (FANEM), misturador digestor de líquidos (HEIDOLPH) e centrífuga (CELM) EQUIPAMENTOS

8 RWA Lavadora de placas Wellwash 4 – Labsystems Leitora de placas Multiskan Ascent - Labsystems

9 RWA

10 Glúten de trigo (gluten from wheat) SIGMA –– G5004 Gliadina (Gliadin): SIGMA – G-3375, PADRÕES DE CONTROLE RWA

11 KITS TRANSIA PLATE PROLAMINS DIFFCHAMB – Art. N PR0320 RIDASCREEN® GLIADIN R BIOPHARM - Art. N R7001 RWA

12 Amostras do teste de gliadina: controle negativo, controle A e controle B (positivas)

13 RWA KIT PARA ELISA COMPOSIÇÃO: ω GLIADINA e R5 Substrato TMB concentrado (tetrametilbenzidina) Solução de lavagem concentrada (tampão Tris-salino) Solução diluente concentrada (PBS com gelatina e timerosal) Solução finalizadora (ácido fosfórico 25%). Placa de microtitulação com 12 tiras (96 alvéolos) sensibilizada com: * anticorpo anti-ω gliadina (ω gliadina) * pentapeptideo (R5) Padrão de gliadina liofilizada e padrões prontos Conjugado peroxidase anti-gliadina (peroxidase ligada a anticorpo monoclonal de rato Anti-ω gliadina) diluído em PBS Controles alto, médio e baixo

14 RWA DOT DOT ELISA NA DETECÇÃO DE GLIADINA Linhas A – H: Diluição seriada ½. Colunas: 1) Curva-padrão gliadina; 2, 3 e 4) Padrões glúten 3000, 400 e 160ppm; 5) Amostra FAPAS; 6) Sopa de feijão com macarrão; 7) Grão de cevada; 8, 9 e 10) Amido de milho, sopa de vegetais e Arroz - controle negativo ABCDEFGHABCDEFGH

15 RWA CODEX ALIMENTARIUS Alimento naturalmente sem glúten até 20ppm Mistura de alimentos naturalmente sem glúten até 100ppm

16 RWA Dot ELISA ND = Não detectável – Abaixo dos limites de quantificação (10ppm) DETECÇÃO DE GLIADINA EM ALIMENTOS INDUSTRIALIZADOS

17 RWA DESAFIOS 1. Composição do alimento – diferença entre as matrizes quantidade e ingredientes do alimento interferem diretamente na quantificação do analito VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA PARA CADA ALIMENTO 2. Procedência dos ingredientes 3. Diferentes respostas ente os kits Extração Padrão Referência

18 Resultados de controle interlaboratorial FAPAS para Mistura de pão seco (2712B) e Misturas para bolo de chocolate (2733 A e B) Material teste /kitValor de consenso de gl ú ten (mg/Kg) N º escores dentro [z]2 N º total de escores %Intervalo satisfat ó rio 2712-B R-Biopharm 35, ,7-48, B Tepnel & Transia 131, ,4-179, A R-Biopharm 7, B R-Biopharm B Tepnel 61, B Neogen

19 RWA PRIORIDADES Profissionais capacitados Padrões Controles internos Validação do método para os laboratórios Comprovação do resultado com outro método

20 RWA ELISA FONTE DE GLIADINA DOS INGREDIENTES PCR SEQUENCIAMENTO CONCLUSÃO TRABALHO INTEGRADO

21 RWA ALIMENTO IAL CVS ANVISA CELÍACO EQUIPE MULTIDISCIPLINAR CVE

22 RWA


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