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EFEITOS EM MACROMOLÉCULAS PROTEÍNAS. Estrutura dos 20 aminoácidos que compõe as proteínas.

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Apresentação em tema: "EFEITOS EM MACROMOLÉCULAS PROTEÍNAS. Estrutura dos 20 aminoácidos que compõe as proteínas."— Transcrição da apresentação:

1 EFEITOS EM MACROMOLÉCULAS PROTEÍNAS

2 Estrutura dos 20 aminoácidos que compõe as proteínas

3 IMPORTÂNCIA DAS LIGAÇÕES QUÍMICAS FRACAS 1. Ligações covalentes não podem ser as responsáveis pelas interações entre moléculas na célula, pois, por definição, numa ligação covalente os átomos unidos devem pertencer a uma mesma molécula. 2. Ligações fracas ocorrem entre átomos de uma mesma molécula ou moléculas diferentes. 3. Uma ligação química é uma força atrativa que mantém átomos juntos. 4. HbA é mantida por ligações fracas.

4 5. Ligações fracas são facilmente quebradas. 6. Dois H mantidos por ligação covalente H 2 são separados por 0,74 A enquanto que por Van der Waals 1,2 A 7. O máximo de ligações covalentes n o de valência (oxigênio tem 2 valências) 8. No caso de ligações fracas, o fator limitante é puramente espacial

5 9. O ângulo entre duas ligações covalentes é sempre o mesmo. Por exemplo: para ligações fracas o ângulo é variável 10. Quanto mais forte a ligação, maior a energia liberada por ela. A + B AB + energia CH H H H Todos tem 109 o

6 11. CALORIA Cal quantidade de energia necessária para elevar a temperatura de 1 grama de água de 14,5 para 15,5 o C. Em geral, usa-se kcal/mol 1kcal = 26 eV 12. As ligações podem ser quebradas por calor, radiação, etc. AB + energia A + B 13. No equilíbrio temos: conc. AB conc. A x conc. B Keq =

7 14. Energia livre é a energia capaz de realizar o trabalho (G ) G (  G é negativo) reação espontânea no equilíbrio  G = Quanto mais forte a ligação, maior a mudança na “energia livre” que acompanha a sua formação, maior o n o de átomos ligados.

8 16.  G = - R.T.lnKeqR=1,987 cal/ o /mol Keq = e -  G / RT T = temp. absoluta Keq = cte equilíbrio Temperatura = 25 o C (298K)  G para ligações covalentes (H, O, etc) é da ordem de -50 a -110 kcal/mol keq muito alta, portanto a concentração de átomos não ligados será muitopequena.

9 17. Ligações fracas têm energias que variam de 1 a 7 kcal/mol e são constantemente feitas e quebradas. 18. Moléculas polares facilitam a formação de ligações fracas. O 2- H+H+ H+H+ 0,95 A Raio de Van der Waals p/ o oxigênio é 1,4 A Raio de Van der Waals p/ o hidrogênio é 1,2 A 105 o

10 19. Tipos de LIGAÇÕES QUÍMICAS FRACAS a) Forças de Van der Waals b) Pontes de hidrogênio c) Ligações iônicas d) Ligações hidrofóbicas

11 20. Van der Waals Força atrativa que se origina pela aproximação de dois átomos ou moléculas. Energia  1 kcal/mol A

12 21. Pontes de hidrogênio Energia varia entre 3 a 7 kcal/mol. Aparece um hidrogênio ligado covalentemente com alguma carga positiva e um aceptor ligado covalentemente, porém carregado negativamente.

13 10 A fraca 5 A forte 4 A atração e repulsão balanceadas A soma de vários átomos ou moléculas pode chegar a 10 kcal/mol.

14 CR C = O H H HN C R Entre grupos peptídicos C = OHO H H C H Entre grupos OH

15 HO-O- OC = O HO-O- N+N+ H H Entre COO - e OH da Tyr Entre NH 3 + e COO -

16 HO = CO N CC HH R H Entre OH da Serina e um grupo peptídico Ponte de Hidrogênio são mais fortes quando apontam diretamente para o aceptor HO O H mais forte mais fraca O HH O

17 22. Ligações iônicas Têm energia média de 5 kcal/mol Ocorrem entre moléculas que têm uma ou mais unidades de carga positiva ou negativa líquida. Ex: COO - e NH Ligações fracas necessitam de superfícies complementares (chave - fechadura). 24. Moléculas de H 2 O formam pontes de hidrogênio. Moléculas orgânicas que formam pontes de hidrogênio são solúveis em água.

18 25. Moléculas não polares como o Benzeno, em água tendem a se unir ligações hidrofóbicas (tendência da água a excluir grupos não polares) 26. Ligações fracas participam das ligações E - S, dão flexibilidade e a forma das moléculas. 27. Algumas moléculas formam hélices e subunidades. Ferritin tem PM , porém não contém uma única cadeia de a.a., mas 20 polipeptídeos idênticos de cerca de 200 a.a. 28. Subunidades são econômicas e diminuem o erro de síntese

19 Formação de estrutura secundária das proteínas

20 Formação de estrutura terciária das proteínas Exemplo: hemoglobina humana

21 Formação de estrutura quaternária das proteínas Exemplo: hemoglobina humana Deoxihemoblobina Oxihemoglobina

22 Interação Enzima – Substrato Estrutura terciária da Hexokinase A

23 Formação de agregação de proteínas

24 Ação da radiação DIRETA INDIRETA

25 AÇÃO DIRETA 1. Absorção de Energia Excitação e Ionização 2. Processos de transferência de Energia ESR (Ressonância Eletro Spin) R S Termoluminescência Adição de 3 H

26 3. Formação de moléculas danificadas estáveis 4. Características da ação direta 4.a. Relação dose-efeito Teoria do alvo A = Ao. c  Beauragard (1985), Kempner (1986) temperatura dependente Swillens (1986) - considera “target” e a eficiência do “hit” processo multievento estocástico

27 “Teoria do alvo – target size” 1.Num organismo vivo temos um ou mais “target(s)”. 2. A interação da radiação com um organismo vivo é ao acaso 3. Um “hit” ou uma interação da radiação com o target mata, inativa ou induz um efeito radiobiológico no organismo 4. A probabilidade de produção de um hit é proporcional ao tamanho do target.

28 5. Para radiações de alta energia ocorre o que chamamos de ionizações primárias. 6. Uma ionização primária envolve 66 eV de energia  1500 kcal/mol Ligação covalente  100 kcal/mol Ponte de hidrogênio  7 kcal/mol 7. Como as ionizações ocorrem ao acaso, a probabilidade de ocorrer 0, 1, 2,..., n ionizações é dada pela fórmula de Poisson P(n) = e -x (X) n n! Onde x é a função da exposição à radiação.

29 8. Como a energia é muito alta cada vez que ocorre 1 HIT INATIVAÇÃO BIOLÓGICA 9. A probabilidade de não ocorrer ionizações é P(0) = e –x  A curva de sobrevivência ou atividade biológica medida após várias exposições decrescerá como uma simples exponencial A= A 0.e -KD A = Atividade após a dose D de irradiação A 0 = Atividade inicial

30 A exposição é dada em unidades de ionização primárias por cm 3 K é a constante característica de cada atividae biológica cuja uniadade é volume (cm 3 ) K é chamado RADIATION TARGET ou VOLUME SENSÍVEL Como as ionizações ocorrem ao acaso e a energia é alta: a sensibilidade é independente da FORMA e da COMPOSIÇÃO QUÍMICA do alvo

31 Para radiações não ionizantes, por exemplo UV, a energia absorvida depende de fatores tais como presença de ANÉIS AROMÁTICOS, PTES. DE ENXOFRE, etc. O target size K é obtido a partir da dose 37% ou D 37 que é a dose necessária para reduzir a atividade para 37% da inicial. A = 0,37 A 0 0,37 A 0 = A 0. e -KD37 ln 0,37 = -1 = -KD 37 K = 1 D 37

32 Cálculo do Peso Molecular Considerando: 1.RAD é a deposição de 100 ERGs de energia por cm 3 de material. 2. Densidade da proteína. 3. O número de Avogadro. 4. Uma série de dados obtidos por radiação. Chegou-se a uma equação empírica Peso molecular = 6,4 x 1011 D 37 D 37 em RADs

33 1. Se tivermos mais de uma molécula, teremos soma de exponenciais 2. Só é válido para efeito direto da radiação (irradiação a seco) Exemplos da literatura EnzimaPM x Target sizeRadiação Malato desidrogenase 7473e-e- Catalase232230RX Lisozima1415e-e- ATPase284280e-e- Glutamato desidrogenase e-e- Fosforilase de amido 

34 EnzimaPM x No. de cadeias PM x Target size Radiação Álcool Desidrogenase  Xantina Oxidase  Glucose e Fosfatase  Peroxidase4014   Amilase  Fosfatase Alcalina e-e-

35 Crotoxina 1. É a toxina mais potente do veneno de cascavel brasileira 2. PM por várias técnicas: Cristalizável 4. Contém duas subunidades CROTAPOTIN = PM  FOSFOLIPASE A 2 = PM  TOXICIDADE Crotoxina: LD 50 = 0,05 mg/kg camundongo Fosfolipase A 2 : LD 50 = 0,55 mg/kg camundongo Crotapotin: LD 50  100 mg/kg camundongo A interação das duas proteínas aumenta a toxicidade 10 vezes (não covalente)

36 Importância da fosfolipase A 2 C O = P R O O C H 2 C O C = O O HH H xxxxxxxx xxxxxxxx ,2 diacil fosfoglicerídeos R = colina Fosfolipase A 2 POLAR APOLAR - CH 2 - CH 2 - N + - CH 3 CH 3 Leticina

37 A dor é provocada pelo estímulo do receptor da dor, que é chamado nociceptor. PEI 2 e PGE 2 agem na membrana destes receptores alterando a atividade elétrica, produzindo estímulos de dor levados pelos nervos sensitivos ao sistema nervoso central. Bactérias Pirogênio exógeno Macrófagos Pirogênio endógeno Circulação C.N.C. PGE 2 Altera o centro regulador do hipotálamo Temp. 37 o C do sangue como fria Ordena vaso constrição periférica Evita perda de calor. Ao mesmo tempo Tremores gera calor. Isto tudo leva à febre. Aspirina age no mesmo ponto.

38 Mecanismo de ação J.R. Vane (Nobel, 1982) Sérgio H. Ferreira - Med. Rib. Pretodécada de 70 COOH Fosfolipídeos da membrana Fosfolipase A 2 O O HO O COOH Ácido aracdônico Ciclo oxigenase Endoperóxidos cíclicos Prostaglandinas clássicas OH O O COOH ASPIRINA Prostaciclina PGE 2 PGI 2

39 RESULTADOS EXPERIMENTAIS 1. Irradiação de Fosfolipase A 2 e Crotoxina 1mg/mL - Liofilizada - em placas de Petri, elétrons acelerados com doses de 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 Mrad. 2. Dissolução das amostras em solução fisiológica. 3. Determinação da atividade enzimática usando gema de ovo como substrato e glóbulos vermelhos de rato.

40 FOSFOLIPASE A 2 CROTOXINA D 37 = 8 Mrad PM = Agregação ? Em gráfico semi log D 37 = 19 Mrad PM =

41 4.b. Fatores que afetam a radiosensibilidade das moléculas b.1 Temperatura Dose Mrad Ativ. Enz. 310 K 195 K 77 K Inativação da Ribonuclease por 60 Co (  ) no vácuo

42 b.2. Presença de O Mm Hg Radioss. 2 1 Radiosensibilidade da Tripsina seca, irradiada com 60 Co D 37 oxigênio D 37 no vácuo

43 b.3. Presença da segunda molécula Radiosensibilidade relativa de enzimas no estado sólido irradiadas na presença de diferentes aditivos D 37 nenhum / D 37 aditivo

44 b.4. Conteúdo de água % água Dose 37 x 10 6 Arilesterase Colinesterase

45 b.5. Efeito do pH ,58,5 pH Dose 37 x ,5 Deoxiribonuclease dissolvida em tampão fosfato pH 3,5 - 8,5, liofilizado e inativado com 60 Co

46 AÇÃO INDIRETA Reação entre as moléculas do soluto e as espécies reativas do solvente, formadas pela ação direta da radiação 1. Espécies reativas da água H 2 O H + OH + e - aq + H 2 + H 2 O 2 + H 3 O + Valores de G a pH neutro

47 2. Algumas reações dos produtos da radiólise com o soluto 2.a. Abstração de átomos de H R H + H R H 2 2.b. Reações dissociativas R NH e - aq R +NH 3 2.c. Reação de adição C=CCCOH HHH RR +R R

48 2.d. Dimerização e adição NH 2 CH 2 COOH CH 2 COOH He - aq Glicina NH 2 CH COOH CH 2 COOH Ácido aspártico

49 2.e. Reações de desprotonação 2 CH 3 CH 2 OH2 CH 3 CH OH CH 3 COH CH 3 CH 2 OH álcool acetaldeído 2.f. Hidrólise RCO NH CH R 2 RCOR RCO NH 2 + H 2 O OH

50 0 1 5 X G 0,1 0,01 DNA ase G de inativação

51 0 1,0 100 Conc. DNA (%) 0,110 G 0,5 G da formação de grupos monofosfatos (quebras simples da cadeia)

52 2.h. Transferência de H 2.g. Adição de oxigênio RO 2 O2O2 RO 2 HR+ CH 2 OHCH 3 OHRSH+RS+

53 3. Fatores que afetam a radiosensibilidade das moléculas frente à radiação indireta 3.a. Concentração do soluto (‘efeito da diluição’) Geralmente o efeito da diluição está entre 0,1 e 10% para macromoléculas e para moléculas pequenas, como a glicina, entre a M ,0 1 Fração relativa Conc. Carboxi Peptidase conc x conc dose

54 3.b. Presença do segundo soluto Tipo de reação competitiva (Scavengers) 3.c. Efeito do oxigênio Em algumas moléculas o O 2 pode aumentar o dano de 2 ou 3 vezes. Embora isto não seja observado em algumas enzimas e no DNA. 3.d. Efeito do pH O pH altera a distribuição de cargas na superfície molecular além da conformação molecular. 3.e. Efeito do tipo de radiação LET é menos efetivo em soluções diluídas

55 Mudanças na estrutura primária 1. Destruição de aminoácidos  entre proteínas 2. Gly e Ala 3. Cys, His, Met, Phe, Tyr, Trp estão entre os mais radiosensíveis 4. Formação de grupos carbonilas a partir de quebras da ligação C - N 5. Formação de fragmentos de PM formação de agregados Por exemplo: crosslink  s poli ala poli phe

56 Mudanças na estrutura secundária 1. Desestabilização das pontes de H 2. Agregação Por exemplo: % amino grupos de Lys ñ nativos  globulina BSA Dose x rad elétrons de Z MeV 1. Estrutura quaternária 2. Dissociação de subunidade

57 Ocorre, em seguida, uma reação em cadeia que pode ser interrompida de duas maneiras H + H 2 O 2 OH + H 2 O OH + H 2 H + H 2 O Que termina OH + H H 2 O ou OH + H 2 O 2 HO 2 + H 2 O HO 2 + H H 2 O 2

58 Do ponto de vista de rendimento, quando a radiação atinge moléculas de água, temos: 28% de ionização 26% de excitação 47% de superexitação

59 H 2 O H 2 O H + OH H 2 O H 2 O + + e - H + + OH + H 2 O H 2 O - H + OH - e - + H + H +H 2 O e - aq H 2 O + H 2 O H 2 O - H + OH - exitação ionização

60 EFEITO DA RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA - UV

61 Efeito da radiação UV A) Absorção UV causa como efeio biológico excitação de parte das macromoléculas. O primeiro passo é a absorção de QUANTA - um processo que ocorre ao acaso QUANTA: São pulsos de energia que para uma dada frequência  de luz que tem a mesma energia definida como E = h h = cte. de Plank = 6,63 x J. seg 1 eV = 1,6 x Jaule

62 A absorção ocorre ao acaso e segue a equação: I/I 0 = e -nsl I = Intensidade transmitida I 0 = Intensidade incidente n = número de partículas absorventes/cm 3 l = comprimento do trajeto da amostra em cm s = cte. que depende da natureza das partículas e comprimento de onda da radiação

63 B) Rendimento quântico A probabilidade da UV provocar uma alteração mensurável é pequena porque a energia pode ser dissipada como fluorescência ou calor. Esta probabilidade é chamada rendimento quântico , que é o número de partículas danificadas pelo número QUANTA absorvido.  é da ordem de ou menos para macromoléculas biológicas

64 C) Radiação Monocromática Usando-se prismas que filtram a luz UV, obtém-se bandas da ordem de 20 A com intensidade suficiente para produzir efeitos biológicos. D) Curva Dose-Efeito A inativação de enzimas obedece a equação: N/N 0 = e -  D Onde: D = dose em QUANTA/cm 2  = é a sensitividade que varia com o comprimento de onda Se  D = 1 N/N 0 = 1/2 = 37% Dose = 37%

65 CURVAS DE INATIVAÇÃO % sobrevida QUANTA / cm 2 x % sobrevida QUANTA / cm 2 x % sobrevida QUANTA / cm 2 x % sobrevida QUANTA / cm 2 x A 2650 A 2805 A 0,010,020, A2537 A 2375 A A 2650 A A 2303 A2652 A C) Inativação de DNA de haemophilus influenzae A) Inativação de gramicidin (11 a a ) B) Inativação de Bacteriófago T2 D) Inativação de Hema glutinina de vírus influenzae

66 AÇÃO EM PEOTEÍNAS E SEUS CONSTITUINTES Pode ocorrer - Rompimento de ponte C - C - Desaminação - Oxidação para formar carboxil ou ceto grupos - Transferência de amino grupos Phe, Tyr, Trp e cistina são os mais sensíveis. Deles, cistina é o mais sensível  para produzir cisteína é 0,2; para formar NH 3, H 2 S é 0,04 e 0,02 respectivamente  para produzir NH 3 a partir de Phe, Tyr e Trp é 0,002  para destruição de cistina é 0,13; 10 vezes maior que para os aa aromáticos

67 INATIVAÇÃO DE ENZIMAS E A.A. Os QUANTA absorvidos pela cistina são os maiores responsáveis pela inativação por causa do rompimento das pontes S - S.  % 1/2 cistina 0,01 0,03 0,02 T CHT CH TDD PAC L R I I - insulina R - RNAase L - lisizima CH - quimiotripsina P - pepsina TD - triposfato desidrogenase A - aldolase D - DNAase C - catalase G - gramicidin CHT - quimiotripsinogênio

68  medido em água ou com proteína seca dá resultados semelhantes  solvente parece não ser importante. RNAase dá mesmo  para 95% etanol ou 100% H 2 O. Comprimento de onda é importante para algumas enzimas. pH: não parece ser importante - lisozima tem mesmo  a pH T menor sensibilidade das proteínas O 2 não afeta Conc. da proteína não afeta


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