Produção de proteínas recombinantes em microrganismos

Apresentação em tema: "Produção de proteínas recombinantes em microrganismos"— Transcrição da apresentação:

1 Produção de proteínas recombinantes em microrganismos
3/25/2017 Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II Produção de proteínas recombinantes em microrganismos Prof. Fabricio Rochedo Conceição 05 de abril de 2011 1

2 Proteína recombinante
DNA recombinante Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes. Proteína recombinante Proteína produzida a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.

3 Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?
Estudos bioquímicos Determinação da estrutura 3D Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico... Alternativa para as seguintes limitações: Quantidade Dificuldade de purificação a partir do tecido original Contaminação (príons, vírus, oncogenes...) Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

4 Pneumonia Micoplásmica Suína
Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

5 Enterite necrótica das aves
Clostridium sp. Botulismo Enterite necrótica das aves Toxina botulínica Enterite suína

6 Sistemas de expressão heteróloga
***Animais e plantas

7 Produção de proteínas recombinantes em bactérias
Escherichia coli Bacillus subtilis Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado!

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12 Relação volume meio – capacidade do frasco
0,2 (20%) Inóculo – 5 a 10%

13 Algumas companhias que comercializam vetores de expressão

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15 Expressão heteróloga em E. coli
Vantagens Desvantagens Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais Enorme variedade de vetores disponíveis Atividade biológica pode diferir da proteína natural Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

16 *** Alternativas

17 Minimizar a proteólise
Maximizar a expressão Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas) Facilitar o folding Solubilidade

18 Expressão heteróloga em B. subtilis
Vantagens Desvantagens Não patogênico (sem LPS); GRAS Proteases extracelulares Codon usage adequado Plasmídeos instáveis Possibilidade de secreção da proteína Expressão geralmente menor que E. coli Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas Alta produção de proteínas heterólogas *** Alternativas

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20 Leveduras Multiplicação rápida Manipulação simplificada
Altas densidades celulares Unicelulares Não Patogênicas (GRAS) Fisiologia e genética bem conhecida Realiza modificações pós-traducionais Promotores “fortes” (constitutivos ou induzíveis)

21 Principais espécies utilizadas
Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha (Pichia augusta) Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Schwanniomyces occidentalis Yarrowia lipolytica

22 Saccharomyces cerevisiae

23 Desvantagens Saccharomyces cerevisiae
Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose Alteração da antigenicidade da proteína Alteração da estrutura 3D Produção de Etanol – tóxico Falha na secreção de proteínas Alternativa: outras espécies de leveduras

24 Proteínas expressas Vacinas Antígeno do vírus da Hepatite B (1986)
Proteína de envelope do HIV-1 Diagnóstico Proteína do vírus da Hepatite C Antígenos do HIV-1 Agentes terapêuticos humanos Insulina GM-CSF Fator de crescimento Soro albumina humana

25 Pichia pastoris Metilotrófica – metanol como fonte única de carbono
Glicosilação mais estável e semelhante a de mamíferos Fermentação pobre – não produz etanol e atinge altas densidades celulares Alta produtividade: até 12g de proteína recombinante por litro de cultivo!

26 Pichia pastoris

27 Pichia pastoris Desvantagens Proteólise de proteínas secretadas
Poucos vetores disponíveis (Invitrogen) Necessita o uso de fermentadores para atingir alta densidade celular – no entanto não realiza fermentação. Precisa de oxigênio!

28 Metabolismo do Metanol
Álcool Oxidase Dois genes: AOX1 e AOX2 AOX1 é mais expresso e altamente induzido na presença de metanol Enzima tem baixa afinidade por metanol, formando formaldeído. Compensa produzindo grande quantidade de AOX (~30% do total de prot)

29 Metabolismo do Metanol

30 Metabolismo do Metanol
Vantagem Fonte de carbono de custo reduzido Só passa a ser utilizado quando já há alta densidade celular Desvantagem Inflamável e tóxico Controle rígido dos níveis de oxigênio (~30%)

31 Fenótipos Mut = Metanol Utilization
Mut+ - crescimento rápido em metanol MutS – crescimento lento em metanol

32 Cepas

33 CLONAGEM - INTEGRAÇÃO

34 Proteínas expressas em Pichia