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Produção de proteínas recombinantes em microrganismos Prof. Fabricio Rochedo Conceição 05 de abril de 2011 Graduação em Biotecnologia.

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1 Produção de proteínas recombinantes em microrganismos Prof. Fabricio Rochedo Conceição 05 de abril de 2011 Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II

2 Proteína recombinante Proteína produzida a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado. DNA recombinante Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes.

3 Por que produzir e purificar proteínas recombinantes? Estudos bioquímicos Determinação da estrutura 3D Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico... Alternativa para as seguintes limitações: Quantidade Dificuldade de purificação a partir do tecido original Contaminação (príons, vírus, oncogenes...) Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

4 Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

5 Clostridium sp. Botulismo Enterite necrótica das aves Enterite suína Toxina botulínica

6 Sistemas de expressão heteróloga ***Animais e plantas

7 Produção de proteínas recombinantes em bactérias Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado! Escherichia coliBacillus subtilis

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12 Relação volume meio – capacidade do frasco 0,2 (20%) Inóculo – 5 a 10%

13 Algumas companhias que comercializam vetores de expressão

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15 VantagensDesvantagens Genética e fisiologia bem conhecidasNão faz certas modificações pós-traducionais Enorme variedade de vetores disponíveisAtividade biológica pode diferir da proteína natural Fácil controle da expressão gênicaA bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas Facilidade de manutenção em laboratórioFalta de um mecanismo de secreção Alta produção de proteínas heterólogasFormação de corpos de inclusão Expressão heteróloga em E. coli

16 *** Alternativas

17 -Minimizar a proteólise -Maximizar a expressão -Minimizar vazamento de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas) -Facilitar o folding -Solubilidade

18 VantagensDesvantagens Não patogênico (sem LPS); GRASProteases extracelulares Codon usage adequadoPlasmídeos instáveis Possibilidade de secreção da proteínaExpressão geralmente menor que E. coli Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas Alta produção de proteínas heterólogas Expressão heteróloga em B. subtilis *** Alternativas

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20 L EVEDURAS Multiplicação rápida Manipulação simplificada Altas densidades celulares Unicelulares Não Patogênicas (GRAS) Fisiologia e genética bem conhecida Realiza modificações pós-traducionais Promotores fortes (constitutivos ou induzíveis)

21 P RINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha (Pichia augusta) Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Schwanniomyces occidentalis Yarrowia lipolytica

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23 D ESVANTAGENS Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose Alteração da antigenicidade da proteína Alteração da estrutura 3D Produção de Etanol – tóxico Falha na secreção de proteínas Alternativa: outras espécies de leveduras

24 P ROTEÍNAS EXPRESSAS VacinasAntígeno do vírus da Hepatite B (1986) Proteína de envelope do HIV-1 DiagnósticoProteína do vírus da Hepatite C Antígenos do HIV-1 Agentes terapêuticos humanos Insulina GM-CSF Fator de crescimento Soro albumina humana

25 Metilotrófica – metanol como fonte única de carbono Glicosilação mais estável e semelhante a de mamíferos Fermentação pobre – não produz etanol e atinge altas densidades celulares Alta produtividade: até 12g de proteína recombinante por litro de cultivo!

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27 Desvantagens Proteólise de proteínas secretadas Poucos vetores disponíveis (Invitrogen) Necessita o uso de fermentadores para atingir alta densidade celular – no entanto não realiza fermentação. Precisa de oxigênio!

28 M ETABOLISMO DO M ETANOL Álcool Oxidase Dois genes: AOX1 e AOX2 AOX1 é mais expresso e altamente induzido na presença de metanol Enzima tem baixa afinidade por metanol, formando formaldeído. Compensa produzindo grande quantidade de AOX (~30% do total de prot)

29 M ETABOLISMO DO M ETANOL

30 Vantagem Fonte de carbono de custo reduzido Só passa a ser utilizado quando já há alta densidade celular Desvantagem Inflamável e tóxico Controle rígido dos níveis de oxigênio (~30%)

31 F ENÓTIPOS Mut = Metanol Utilization Mut + - crescimento rápido em metanol Mut S – crescimento lento em metanol

32 C EPAS

33 CLONAGEM - INTEGRAÇÃO

34 P ROTEÍNAS EXPRESSAS EM P ICHIA


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