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Bioinseticidas Bruno Francisco R. Fazenda Guilherme Lopes Julia Fernandes Microbiologia Industrial Prof. Maria Bernadete 2014.

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1 Bioinseticidas Bruno Francisco R. Fazenda Guilherme Lopes Julia Fernandes Microbiologia Industrial Prof. Maria Bernadete 2014

2 O que são Bioinseticidas? Inseticida: todo composto químico capaz de combater insetos. Bioinseticida: todo composto com utilização racional de bactérias, fungos, vírus e nematoides para o controle de insetos. Bacillus thuringiensis

3 Arsênio, Mercúrio e tabaco: usados como inseticida. Em 1948, o cientista Paul Muller ganhou o Prêmio Nobel de Química por ter descoberto o mais famoso inseticida de todos o tempos, o DDT (Dicloro Difenil Tricloroetano). Inseticidas: tóxicos, alto custo de pesquisas, necessidade de novas moléculas por causa da resistência dos insetos... Bioinseticida: surge com a necessidade no investimento em inseticidas alternativos, devido aos prejuízos causados pelos que estavam em uso. Desenvolvimento DDT

4 Maior tempo de uso; Menos poluentes; Altamente específicos; Dificuldade dos insetos em resistir; Menor custo de desenvolvimento. Desvantagem: dificuldade no isolamento de novos microrganismos, principalmente nos Bioinseticidas à base de fungos. Características dos Bioinseticidas

5 Cana-de-açúcar no Brasil: combate das cigarras pelo fungo Metarhizium anisopliae é um dos programas mais antigos no Brasil. AgNPV (Vírus da Poliedrose Nuclear da lagarta-da-soja Anticarsia gemmatalis) é o mais pesquisado e aplicado no Brasil, tornando-se o maior programa de controle microbiano de pragas, utilizando vírus, do mundo. Atualmente, 90% do mercado mundial de Bioinseticidas utilizam Bacillus thuringiensis, bactéria amplamente aplicada e estudada para o combate de larvas de pernilongo. Alguns tipos de Bioinseticidas

6 : morte de lagartas do bicho-da-seda (Bombix mori) no Japão, causada por bactéria; : isolado por Berliner, da lagarta da traça do trigo (Anagasta kuehniella). Nomeou a bactéria em homenagem à Thuringia (Alemanha); : comercialização do primeiro Bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis

7 Bactéria presente em solos. Gram positiva. Formadora de esporos. Anaeróbia facultativa. Capacidade de sintetizar um cristal protéico com ação tóxica contra insetos suscetíveis. Assimilação de diferentes substratos (glicose, maltose, frutose, glicerol). Bacillus thuringiensis

8

9 Doença causada por vírus (4 sorotipos diferentes). Transmitida pelo Aedes aegypti. Sintomas: - febre alta; - dores musculares; - dores nos fundos dos olhos; - náuseas e vômitos. Dengue

10 Produção de Bioinseticida para combater a larva do mosquito da dengue

11 Bacillus thuringiensis

12 Cristal Proteico  Produzidos no interior da célula, adjacente ao esporo  Denominados proteínas Cry, δ-endotoxinas ou proteínas inseticidas  Quatro endotoxinas produzidas por Bacillus thuringiensis var. israelensis: -Cry4A (125 kDa)- Cry4B(134 kDa) - Cry11A (67 kDa) - Cyt1A (27 kDa)

13 Cristal Proteico Mecanismos de Ação

14 Cristal Proteico Mecanismos de Ação  Deformação das células epiteliais e a desintegração da membrana microvilar  Lise celular, danos irreversíveis no intestino, culminando com a morte da larva

15  Microscopia eletrônica do epitélio intestinal da larva antes e após a ação da toxina

16 Cristal Proteico  Eficaz contra larvas de insetos dos gêneros Aedes, Culex e Anopheles, vetores das doenças dengue, elefantíase e malária.  Eficaz contra larvas de insetos do gênero Simulium (borrachudos), transmissores de vírus, protozoários e filárias

17 Meios de Cultivo ComponenteConcentração (g/L) Glicose10,0 Extrato de Levedura12,0 (NH 4 ) 2 SO 4 3,0 CaCl 2.2H 2 O0,12 MgSO 4.7H 2 O1,5 MnSO 4.H 2 O0,09 K 2 HPO 4 1,5 KH 2 PO 4 1,5 Composição do meio GYS (ROGOFF; YOUSTEN, 1969) ComponenteConcentração (g/L)Glicerol 10,0 Extrato de Levedura12,0 (NH 4 ) 2 SO 4 3,0 CaCl 2.2H 2 O0,12 MgSO 4.7H 2 O1,5 MnSO 4.H 2 O0,09 K 2 HPO 4 1,5 KH 2 PO 4 1,5

18 Dihidroxicetona-3-fosfato Gliconeogênese Ciclo de Krebs Piruvato Acetil -CoA ADP ATP Acetil- Fosfato Ácido Acético NAD + NADH 2 CO 2 FADH 2 NAD + NADH 2 Glicerol desidrogenase Dihidroxicetona quinase ATP ADP ATP ADP FAD Glicerol 3-P desidrogenase Glicerol quinase Dihidroxicetona Glicerol-3-fosfato Oxaloacetato, α-Cetoglutarato Proteínas Tradução Aminoácidos Glicerol NAD + NADH 2 ATPADP Biomassa Frutose-difosfato Via das Pentoses Fosfato

19 Biodiesel Obtenção Obtenção (reação de transesterificação) (reação de transesterificação) TriacilglicerídeoÁlcoolGlicerol Biodiesel 10% do volume total do biodiesel produzido é constituído de glicerol (CHI et al. 2007)

20 Preparo de Inóculo Bacillus thuringiensis var. israelensis Frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio 30 o C sob agitação de 96 rpm por 10 horas

21 Ensaios de Fermentação em Frascos  Fermentação realizada em Erlenmeyer de 1 L, sem chicanas  Pellet resultante da centrifugação do inóculo  Agitação de 96 rpm, a temperatura de 30 0 C

22 Obtenção da curva de pH característica  Fermentação realizada em Erlenmeyer de 1 L, com e sem chicanas  Amostras retiradas em intervalos de tempo definidos

23 Métodos Analíticos Concentração Celular  Turbidimetria: antes da formação de grumos  Gravimetria: ao iniciar a formação de grumos Morfologia Celular  Observações em Microscópio Ótico

24 Métodos Analíticos Concentração de Glicerol e Ácido Acético  Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (coluna HPX-87H) Atividade Larvicida  Exposição, por 24 horas, de larvas de Aedes aegypti no 3º ínstar de crescimento a volumes diferentes de meio fermentado e água, num total de 6 mL.  Para cada teste foram utilizados 10 tubos, empregando-se o mesmo volume de meio fermentado.

25 Empresas  Biosphere ;  Bug ;  Bayer Cropscience;  AgroPlan-UFV;  BR3-FioCruz;  Laboratório de Controle Biológico do Centro Experimental do Instituto Biológico;

26 Produção  No mercado há cerca de 100 empresas;  Estão em fase de pesquisas  Buscam a regulamentação de seus produtos;  Ligadas a universidades e centros de pesquisa;  Grande investimento acreditando no futuro promissor;

27 Faturamento Dias atuais15 anos

28 Porque usar bioinseticidas  Mais específicos;  Maior aceitação popular;  Os insetos e plantas não desenvolvem resistências;  Menor impacto ambiental;  Menor dano à saúde;  Menor contaminação de alimentos;  Produtos biológicos melhores e mais baratos;

29 OBRIGADO!!!!


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