Fecundação Primeira função: Transmitir os genes dos progenitores aos descendentes Segunda função: é iniciar, no citoplasma do óvulo, as reacções que permitam.

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1 Fecundação Primeira função: Transmitir os genes dos progenitores aos descendentes Segunda função: é iniciar, no citoplasma do óvulo, as reacções que permitam prosseguir o desenvolvimento.

2 Fecundação: 1- contacto e reconhecimento entre o espermatozóide e o óvulo. Tal assegura que o espermatozóide e o óvulo são da mesma espécie 2- regulação da entrada do espermatozóide no óvulo. Normalmente, apenas um espermatozóide pode fecundar o óvulo. 3- fusão do material genético do espermatozóide e do óvulo. 4- activação do metabolismo do óvulo para iniciar o desenvolvimento

3 Estrutura dos gâmetas 1.Espermatozóide A importância do espermatozóide na fecundação foi apenas reconhecido nos últimos 125 anos Primeiro, acreditava-se que os espermatozóides eram parasitas que viviam no interior do sémen (spermatozoa-animais do esperma Depois, alguns autores pensavam que o espermatozóide continham um ser humano pré-formado, designado por homonclus) No entanto, a maioria pensava que o espermatozóide não era importante

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5 Foi no século XVIII, que surgiram as primeiras provas da importancia do espermatozóide na reprodução, Spallanzani demonstrou que o sémen de sapo, sem espermatozóide, não fecundava o óvulo. Em 1824, Prevot e Dumas afirmaram que o espermatozóide não eram parasitas mas sim os agentes activos da fecundação Em 1840, A. Von Kolliker concluiu que não era um parasita, e que o espermatozóide excitava o óvulo para que se este se desenvovesse, não havendo por isso contacto fisíco entre gametas. Apenas em 1876 Hetwig e Fol, demonstraram a entrada do esprmatozóide no óvulo e a união dos núcleos das duas células.

6 A vesícula acrossómica contém enzimas que digerem proteínas e açucáres, e são usadas para destruir as camadas externas do óvulo O modo como o espermatozóide se move varia de espécie para espécie, por exemplo nas lombrigas realiza movimentos amebóides, mas na maioria das vezes as espécies movimentam-se através do batimento dos flagelos

7 Cada espermatozóide, é constituído por um núcleo haplóide, um sistema propulsor e uma bolsa de enzimas

8 Estrutura dos flagelos A parte motora principal é o axonema. O centro do axonema consiste em 2 microtúbulos centrais rodeados por 9 dupletos de microtúbulos. Apenas um dos microtúbulos se encontra completo com 13 protofilamentos, o outro em forma de C tem apenas 11 protofilamentos Os protofilamentos são constituídos por uma proteína dímerica, a tubulina. A força para a propulsão dos espermatozóides é fornecida pela dineína, uma proteína ligada aos microtúbulos. Ela vai hidrolisar o ATP que provém dos anéis de mitocôndrias localizados na zona intermédia do espermatozóide Outra proteína flagelar importante é a Histona H1, é responsável pela estabilização dos microtúbulos flagelares

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10 Óvulo Acumula diversas reservas citoplasmáticas durante a sua maturação: -Proteínas – as células embrionárias iniciais vão precisar de energia e aminoácidos. -Ribossomas e tRNA – o embrião jovem vai necessitar de produzir muitas das suas proteínas -RNA mensageiro – As instruções para a produção de proteínas estão empacotadas nos óocitos -Factores morfogenéticos – vão estar presentes móleculas que dirigem a diferenciação celular em determinados tipos de células -Compostos protectores – Cóntem filtros ultra-violeta, enzimas de reparação de DNA. Algumas móleculas contém móleculas que sabem mal aos predadores. A membrana celular regula o fluxo de iões durante a fecundação e tem de ser capaz de se fundir com a membrana celular do espermatozóide Exterior à membrana celular encontra-se um envelope celular que esta Frequentemente envolvido no reconhecimento espermatozóide-óvulo. Esta estrutura é designada por camada vitelina, nos mamíferos, é constituída por uma matriz extra-celular espessa e separada da membrana designada por zona pelúcida.

11 O óvulo do mamífero está também rodeado por uma camda de células, o cumulus oophorus. A camada mais interna das células do cumulus oophorus, imediatamente adjacente à zona pelúcida, chama-se corona radiata. Imediatamente por baixo da membrana celular do óvulo encontra-se uma concha fina e gelatinosa designada por córtex. Nesta região o citoplasma é mais rígido e contém uma elevada concentração de moléculas de actina. Durante a fecundação, estas moléculas polimerizam e formam microfilamentos. Estes microfilamentos são necessários para prolongar a superfície do óvulo em pequenas projecções designadas Por microvilosidades, que podem auxiliar a entrada de espermatozóides.

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13 No interior do córtex encontram-se também os grânulos corticais. São derivados do complexo de Golgi que contêm enzimas proteolíticas

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15 Reconhecimento do óvulo-espermatozóide 1. Quimoatracção do espermatozóide em direcção ao óvulo, por acção de moléculas solúveis segregadas pelo óvulo 2. Ligação do espermatozóide ao envelope extra-celular (camada vitelina ou zona pelúcida) do óvulo 2. Exocitose do acrossoma para libertar as suas enzimas 4. Passagem do espermatozóide através deste envelope extracelular. 5. Fusão das membranas celulares do óvulo e do espermatozóide

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17 Acção à distância: gâmetas de mamíferos É muito díficil estudar as interacções que podem ocorrer entre os gâmetas de mamíferos antes do contacto entre eles. Existem duas razões óbvias para obstar este estudo: 1.Dificuldade em reproduzir as condições que os espermatozóides vão encontrar no interior da fêmea; 2.A população de espermatozóides que é ejeculada é muito heterogénea no seu estado de maturação. Por isso, existe muita especulação sobre os mecanismos de translocação e capacitação dos espermatozóides.

18 Translocação e capacitação O espermatozóide vai ser transportado até ao oviducto essencialmente pela acção da actividade muscular do útero. Só dentro do oviducto é que importante a mobilidade conferida ao espermatozóide para ele se encontrar com o óvulo. Os espermatozóides récem-ejaculados são incapazes de de levar acabo a reacção acrossómica sem permanecerem algum tempo no tracto reprodutor feminino. Por iiso, necessitam de interagir com as células e secreções do tracto reprodutor feminino para que esta reacção ocorra. O conjunto de modificações fisiológicas através das quais o espermatozóide se torna competente para fertilizar o óvulo designa se por capacitação. A corrida dos espermatozóides nem sempre é ganha pelo mais rápido

19 Uma das hipóteses que poderá explicar a capacitação dos espermatozóides compreende quatro tipos de alterações moleculares: 1.A membrana celular dos espermatozóides é alterada pela remoção de colesterol pelas albuminas no tracto reprodutor feminino. A perda de colesterol poderá aumentar o valor de PH, que vai permitir a reacção acrossómica dos espermatozóides; 2.Determinadas proteínas ou hidratos de carbono perdem-se durante a capacitção. Estes compostos vão bloquear os locais de recepção para as proteínas que se ligam à zona pelúcida, facilitando a penetração dos espermatozóides 3.O potencial de membrana do espermatozóide fica mais negativo quando os iões de potássio saem do espermatozóide. Esta alteração vai permitir a entrada de iões cálcio. Os iões cálcio e bicarbonato são importantes para activar a produção de cAMP e facilitar a fusão das membranas na reacção acrossómica 4. Ocorre a fosforilação proteíca

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21 Diferentes regiões do tracto reproductor feminino podem segregar móleculas localmente específicas Estes factores podem influenciar a mobilidade dos espermatozóides bem como a sua capacitação. Por exemplo, quando espermatozóides em determinados mamíferos pasam pelo útero em relacção ao oviducto, ficam hiperactivados, nadando a maiores velocidades e gerando forças maiores. A hiperactivação, juntamente com a enzima hialuronidase no exterior da membrana celular do espermatozóide, permite ao espermatozóide construir um caminho através da células do cumulus oophorus. Existem evidências que apontam para que o óvulo possa segregar substâncias quimiostáticas que atraem os espermatozóides durante as últimas fases de migração do espermatozóide.

22 Ligação e reconhecimento dos gâmetas em mamíferos Nos mamíferos, a zona pelúcida desempenha as funções de ligar o espermatozóide e iniciar a reacção acrossómica após a ligação ao espermatozóide A ligação do espermatozóide à zona pelúcida é específica para cada espécie. A zona pelúcida é composta fundamentalmente por três glicoproteínas, ZP1, ZP2 e ZP3. Existem várias evidências para que a ZP3 seja a glicoproteína específica a que os espermatozóides se ligam. A ZP3 vai inicia também a reacção acrossómica. Esta reacção é induzida quando a ZP3 interliga os receptores da membrana celular dos espermatozóides. Um dessas proteínas do espermatozóide é a galactotransferase-I. Esta ligação vai activar as proteínas G na membrana celular do espermatozóide, iniciando uma cascata enzimática que abre os canais de cálcio da membrana, provocando a exocitose da vesícula acrossómica.

23 A exocitose da vesícula acrossómica liberta proteases que se ligam à zona pelúcida Estas enzimas criam um buraco através da qual os espermatozóides podem viajar em direcção ao óvulo. No entanto a parte da membrana celular do espermatozóide que se liga à ZP3 é removida do espermatozóide.

24 Fusão dos gâmetas e prevenção da polispermia Nos mamíferos, o espermatozóide contacto com o óvulo não através da extremidade da cabeça, mas com a zona lateral da cabeça, numa região designada por domínio equatorial da cabeça do espermatozóide A fusão dos gâmetas poderá depender da interacção entre uma proteína do espermatozóide e a proteína CD9 associada às integrinas dos ovócitos

25 O bloqueio rápido da polispermia (entrada de vários espermatozóides no óvulo) É conseguido alterando o potencial eléctrico da membrana celular do óvulo. Dentro de 1 a 3 segundos após a ligação do primeiro espermatozóide, o potencial de membrana passa de 70mv (repouso) para +20mv. Está alteração é causada por uma pequena entrada de iões sódio. Os espermatozóides conseguem fundir-se com memembras com um potencial de -70mv, mas não conseguem fundir-se com membranas carregadas positivamente. Assim, não se fundem mais espermatozóides com o óvulo. Este tipo de bloqueio, é transitório podendo ocorrer apenas por breves minutos.

26 Bloqueio lento da polispermia O mecanismo que permite remover em definitivo os espermatozóides da camada vitelina ou zona pelucida é a reacção dos grânulos corticais. Após a entrada do espermatozóide, os grânulos corticais fundem-se com a membrana celular do óvulo e libertam o seu conteúdo. Neste processo são libertadas várias proteínas: a primeira é serina protease dos grânulos corticais. Esta enzima dissolve os receptores da membrana celular que se ligam aos espermatozóides; em segundo lugar, os mucopolissacarídeos são libertados e produzem um gradiente osmótico que leva a que a água entre para o epaço entre a camada vitelina e a membrana celular, provocando a expansão da camada e se torne na camada de fertilização;

27 uma terceira proteína, uma enzima peroxidase, endurece a camada de fertilização. A camada de fertilização começa a formar-se no local de entrada do espermatozóide e continua a expandir-se em torno do óvulo. À medida que se forma, os espermatozóides ligados começam a libertar-se. Este processo começa cerca de 20 segundos após a ligação do espermatozóide e termina no final do primeiro minuto de fecundação; finalmente, um quarto conjunto de proteínas, incluindo a hialina, forma um revestimento em torno do óvulo. O óvulo estende microvilosidades que se ligam a esta camada de hialina.

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29 Fusão do material genético O DNA do núcleo dos espermatozóides está compactado por accção das protaminas que apresentam diversas ligações sulfureto. A glutationa do citoplasma do óvulo vai reduzir estas ligações, permitndo o desenrolar da cromatina do espermatozóide As oscilações de cálcio inactivam a MAP cinase e activam a síntese de DNA. No óocito dos mamíferos os cromossomas estão ainda a meio da metafase meiótica. As oscilações de cálcio activam outra cinase que leva à proteólise da ciclina (permitindo assim que o ciclo continue) e da securina (proteína que mantem os cromossomas metafásicos juntos). Quando os dois envelopes nucleares se encontram, ocorre a ruptura de ambos. No entanto, não produzem imediatamente um núcleo zigótico, isso só acontece na fase das duas células.

30 As mitocôndrias dos espermatozóides são destruídas no citoplasma do ovo, o que faz com que todo o DNA mitocondrial de um indivíduo tenha uma origem unicamente materna. Os ovos dos mamíferos estão entre os mais pequenos do reino animal. O óocito de mamífero é libertado do ovário e arrastado até ao oviducto. A fecundação ocorre na ampola do oviducto. A meiose completa-se nesta altura e a clivagem começa cerca de 1 dia depois. Entretanto, os cílios no oviducto empurram o embrião na direcção do útero.

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32 Desenvolvimento inicial em mamíferos A primeira divisão do ovo é uma divisão meridional normal, já na segunda, um dos dois blastómeros divide-se meridionalmente e o outro equatorialmente. Este tipo de clivagem designa-se por clivagem rotativa. Os blastómeros dos mamíferos não se dividem todos ao mesmo tempo, por isso os embriões dos mamíferos não aumentam exponencialmente (múltiplos de 2), mas possuem frequentemente números ímpares. Outro aspecto importante no processo de clivagem dos ovos mamíferos é a compactação. Durante a fase de 8 células, os blastómeros estão muito soltos havendo muito espaço entre eles. Após essa fase, começam a ser expressas proteínas de adesão celular, como por exemplo as canderinas E, e os blastómeros agregam-se formando uma bola de células compacta. As células no interior da esfera formam junções apertadas que lhes permitem a troca de pequenas moléculas e iões.

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34 Quando o embrião é constituído por 16 células designa-se por estado de mórula. A maioria das células que descendem das células mais externas vão originar o trofoblasto, que não produz qualquer estrutura embrionária, mas que vai originar o córion, a parte embrionária da placenta. É o córion que permite ao feto obter oxigénio e nutrientes a partir da mãe. O córion também segrega hormonas que levam a que o útero retenha o feto, e produz reguladores da resposta imunitária para que a mãe não rejeite o embrião, como faria a um órgão implantado. São as células internas do estado de mórula que vão originar a Massa Celular Interna (MCI), que será responsável pela formação do embrião e do saco vitelino, a alantóide e o âmnio a eles associado. Na fase de 64 células, a MCI (aproximadamente 13 células) e as células do trofoblasto tornam-se camadas de células separadas.

35 As células destas duas regiões expressam genes diferentes, a MCI expressa Otx4 e Foxd3, dois factores associados à pluripotência. As células do trofoblasto expressam o factor de transcrição eomesodermina. Durante o processo de cavitação, as células do trofoblasto segregam um fluído para o interior da mórula para criar um blastocélio, este tipo de blástula é designado por blastocisto.

36 Fuga da zona pelúcida Enquanto o embrião se move no oviducto em direcção ao útero, o blastocistoexpande-se no interior da zona pelúcida. Durante este período, a zona pelúcida evita que o blastocisto adira à parede do oviducto. Quando esta adesão ocorre nos seres humanos designa-se por gravidez ectópica. Esta sitação é particularmente perigosa pois implantação do embrião no oviducto provoca uma hemorragia que pode ser fatal. No útero o blastocisto eclode da zona pelúcida e invade o útero. Essa lise é feita pela estripsina. O epitélio uterno (endométrio) captura o blastocisto, que liberta enzimas que vão digerir o tecido uterino, permitindo que o blastocisto se enterre na parede uterina.

37 Gastrulação em mamíferos O embrião do mamífero obtém os alimentos directamente da mãe e não do vitelo armazenado. Esta adptação originou o desenvolvimento do córion. O córion constitui a parte fetal da placenta e induz as células uterinas a formarem a parte materna da placenta, a decídua. A primeira separação de células no interior do MCI origina dois folhetos: o folheto inferior, o hipoblasto ou endoderme primitiva e o restante tecido da MCI por cima deste, o epiblasto. Este dois folhetos formam o disco germinal bilaminado ou botão embrionário. As células do hipoblasto delaminam da MCI para a cavidade do blastócelio, onde originam a Endoderme extra-embrionária, que forma o saco vitelino (não forma qualquer parte do organismo récem-nascido).

38 As células do epiblasto são divididas em pequenas porções que vão acabar por dividir o epiblasto embrionário das outras células do epiblasto que rodeiam a cavidade amniótica. Uma vez terminado o revestimento do âmnio, a cavidade amniótica enche-se com o fluído amniótico, que serve para absorver os choques sofridos pelo embrião e impede a dessecação. O epiblasto embrionário contém todas as células que irão dar origem ao embrião propriamente dito. A gastrulação tem início na extremidade posterior do embrião e é aqui que se forma o nódulo. As células do epiblasto, a mesoderme e a endoderme, migram através de uma linha primitiva, perdem a caderina E, separam-se das células vizinhas e migram ao longo da linha como células individuais. Estas células vão originar a notocorda. A migração e especificação das células é coordenada pelos genes FGFs.

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40 As células extra-embrionárias estão a produzir os diferentes tecidos dos mamíferos que permitem ao feto sobreviver no interior do útero materno. As células originais do trofoblasto constituem uma camada de células chamada citotrofoblasto, que se dividem em células multinucleadas que originam o sinciciotrofoblasto. O citotrofoblasto adere inicialmente através de uma série de móleculas de adesão. Para além disso estas células contêm enzimas proteolíticas que lhes permite entrar na parede uterina. Pensa-se que o tecido sinciciotrofoblasto promove a progressão do embrião para o interior da parede uterina através da digestão de tecidos uterinos. Depois, o tecido mesodérmico estende-se para fora a partir do embrião em gastrulação. A mesoderme extra-embrionária une as extensões trofoblásticas e dá origem aos vasos sanguíneos que transportam nutrientes da mãe para o embrião.

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42 O pedúnculo estreito que liga o trofoblasto dá origem aos vasos do cordão umblical. O órgão extra-embrionário completamente desenvovido, composto por trofoblasto e mesoderme, contendo vasos sanguíneos, é designado por córion. O córion vai-se fundir com a parede uterina para criar a placenta. Assim, a placenta tem uma porção materna (endométrio uterino) e uma componente fetal (o córion).

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