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1 Seqüenciamento e Análise de Genomas. 2 1953 – Modelo de Watson e Crick - O DNA é uma hélice dupla em que as bases nitrogenadas interagem por pontes.

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1 1 Seqüenciamento e Análise de Genomas

2 – Modelo de Watson e Crick - O DNA é uma hélice dupla em que as bases nitrogenadas interagem por pontes de hidrogênio

3 A replicação do DNA é semiconservativa Lewin,

4 4 Seqüenciamento de DNA Em 1977 o método de seqüenciamento com terminadores de cadeia é desenvolvido Em 1977 o método de seqüenciamento com terminadores de cadeia é desenvolvido Sanger F, Nicklen, S and Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 74: 5463– 5467, 1977

5 5 Seqüenciamento de DNA pelo método de Sanger

6 6 SeqüenciamentoSeqüenciamento de DNA pelo método de Sanger Seqüenciamento

7 7 Manual sequencing uses radiolabeled dATP (35-S or 33-P) to label the DNA. The sample is then split into four tubes each with an individual ddNTP present. The samples are then subjected to acrylamide gel electrophoresis followed by autoradiography G A T C Manual Sequencing

8 8 O INÍCIO DA ANÁLISE DE GENOMAS

9 – Sanger e colegas desenvolvem a técnica de seqüenciamento usando inibidores como terminadores de síntese de DNA. O primeiro genoma completo é seqüenciado - o do bacteriófago phi-x174 (5375 bases). Sanger F et al. The nucleotide sequence of bacteriophage phi-X174. Journal of Molecular Biology 125: , Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74: , – O método de Shotgun é desenvolvido Sanger e colaboradores desenvolveram o método de shotgun para preparar moldes para seqüenciamento de DNA: esse trabalho também apresentou o uso de vírus bacterianos (bacteriófago M13) para clonagem e preparação de moldes. Sanger et al. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing Journal of Molecular Biology

10 10 Early genome sequencing projects The ability to undertake DNA sequencing on a large scale started a revolution in biology, as it became theoretically possible to determine the complete DNA sequence of any organism, and thus obtain a full description of the complete set of genes, or genome. Initially small genomes of viruses and organelles were studied (phiX174, 5.4kb; the mitochodrial genome, 16kb; bacteriophage lambda, 50kb; Epstein Barr virus, 172kb; human cytomegalovirus, 229kb). It became clear that the most efficient means to determine a complete genome sequence was to break the DNA randomly into fragments of appropriate size for sequencing, and then to reassemble the pieces using the DNA sequence itself. Overlaps between the individual pieces were identified on the basis of matches between independently sequenced DNA fragments. This process, termed random shotgun sequencing, was first applied to the whole genome of bacteriophage lambda, and has since been applied to progressively larger projects as the speed of sequencing and the power of computers to undertake the assembly process has increased.

11 IBM introduz o primeiro computador de uso pessoal – ele tinha 100 KB de memória, um driver de disco flexível e custava cerca de $ Compaq introduziu o primeiro computador portátil – sem disco rígido e custava cerca de $ – O primeiro genoma é seqüenciado pela metodologia de shotugun de genoma total (whole genome shotgun - WGS) Sanger e colaboradores seqüenciam o genoma do bacteriófafo Lambda usando a técnica de shotgun. Sanger F et al Nucleotide sequence of bacteriophage lambda. Journal of Molecular Biology. 162: 729–73 Tamanho do genoma – pb

12 – O primeiro protótipo de uma máquina para seqüenciamento de DNA é apresentado Apple introduz o Mac II. Com um disco rígido de 40MB e custo de $ Olson e colegas desenvolvem o método para clonagem de longas regiões de DNA do genoma ( – pares de bases) Burke et al. Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. Science , 1987.

13 – O primeiro sistema de hipertexto – a base da world wide web – foi desenvolvido no European Organisation for Nuclear Research (CERN ) 1989 – Criação da Human Genome Organisation (HUGO) HUGO, uma associação internacional de pesquisadores envolvidos com o Projeto Genoma Humano foi criado para ajudar a coordenar as atividades e auxiliar na distribuição dos dados e recursos – Apresentação, da Proposta formal do Department of Energy e National Institutes of Health, USA, para seqüenciar o genoma humano.

14 Sulston e Waterston solicitam recursos da Wellcome Trust para seqüenciar 40Mb do genoma humano – proposta de cinco anos. Wellcome Trust e Medical Research Council, UK, associam-se ao Projeto Genoma Humano Mosaic Communications – depois Netscape Communications – é criado 1995 – O primeiro genoma de um microrganismo de vida livre é seqüenciado O genoma de Haemophilus influenzae – pares de bases – é seqüenciado pelo The Institute for Genomic Research (TIGR)

15 Seqüenciador automático MegaBace 1000 (96 capilares) 5 corridas/dia = ~ pb 1998 – O seqüenciador ABI Prism 3700 é lançado, com capacidade para analisar oito conjuntos de 96 reações por dia =~ pb Seqüenciador automático MegaBace 4000 (384 capilares) Parte de um eletroferograma gerado no seqüenciamento automático de DNA

16 16 The MegaBACE 1000 DNA Sequencing System features: · Capillary electrophoresis with automated gel matrix replacement, sample injection, DNA separation, and base calling. Unlike slab-gel systems, the automation of gel replacement eliminates the need to pour gels, wash glass plates, and re-track samples after electrophoresis. · Electrokinetic sample injection automatically loads samples from a 96-well plate into the capillaries. Automated sample injection eliminates manual sample loading and sample mix up. · Energy transfer (ET) dye chemistry kits are the most robust and sensitive kits available. DYEnamic ET primers and DYEnamic ET terminator kits are formulated with Thermo Sequenase DNA polymerase and Thermo Sequenase II DNA polymerase, respectively, and are optimized for use with the MegaBACE. · The MegaBACE 1000 uses linear polyacrylamide (LPA) separation matrix. LPA is an innovation in capillary electrophoresis sieving matrices that enables read lengths in excess of 800 bases. With long read lengths; MegaBACE 1000 is ideal for finishing. · Flexible, user-friendly analysis software produces accurate base-calling data in a PHRED-compatible file format.

17 17 DYEnamic ET Terminators The dye terminators feature novel dye-labelled dideoxynucleotides and a new DNA polymerase. Each dideoxy terminator is labelled with two dyes. One of these dyes, fluorescein, has a large extinction coefficient at the wavelength (488 nm) of the argon-ion laser in the instrument. The fluorescein donor dye absorbs light energy from incident laser light and transfers the collected energy using radiationless energy transfer to an acceptor dye. Each of the four chain terminators, ddG, ddA, ddT, and ddC, has a different acceptor dye coupled with the fluorescein donor. The acceptor dyes then emit light at their characteristic wavelengths. The fluorescence is detected by the instrument, which allows the nucleotide that caused the termination event to be identified. Using energy transfer provides a more efficient excitation of the acceptor dyes than does using direct excitation by the laser, and results in a sequencing method that is very sensitive and robust. The acceptor dyes are the same standard rhodamine dyes used in DYEnamic ET primers: rhodamine 110, rhodamine-6-G, tetramethyl rhodamine, and rhodamine X. By using the standard rhodamine dyes as acceptors, the reaction products can be detected using the same filter set as the DYEnamic ET primers. The DYEnamic ET primers for the MegaBACE system are 5-carboxy-fluorescein (FAM) as the donor dye. The acceptor dyes are rhodamine 110 (R110) (C), 6-carboxyrhodamine (REG) (A), N,N,N,N,-tetramethyl-5-carboxyrhodamine (TAMRA) (G) and 5-carboxy-X-rhodamine (ROX) (T).

18 18 Crescimento no número de seqüências no GenBank Revised: February 16, YearBase pairsSequences , ,102,462215, ,939,485555, ,972,9841,021, ,160,300,6871,765, ,008,761,7842,837, ,841,163,0114,864, ,101,066,28810,106, ,849,921,43814,976, ,507,990,16622,318, ,553,368,48530,968, ,575,745,17640,604,319

19 19 Projetos Genoma Vários projetos de seqüenciamento de genomas bacterianos foram ou estão sendo desenvolvidos no mundo, enfocando as mais diversas espécies de organismos como Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholera e inúmeras outras bactérias (248 já concluídos e mais de 402 em andamento);(248 já concluídos e mais de 402 em andamento) Vários genomas eucarióticos também já foram seqüenciados.

20 20

21 21 C. elegans Arabidopsis thaliana human Plasmodium falciparum Drosophila melanogaster Genomas eucarióticos Schizosaccaromyces pombe

22 22 Whole Genomes The Draft Genome of Ciona intestinalis: Insights into Chordate and Vertebrate Origins Paramvir Dehal et al.Science, 13 December 2002, p The Genome Sequence of the Malaria Mosquito Anopheles gambiae Robert A. Holt et al. Science, 4 October 2002, p Whole-Genome Shotgun Assembly and Analysis of the Genome of Fugu rubripes Samuel Aparicio et al. Science, 23 August 2002, p ; published online July 25, 2002, /science A Draft Sequence of the Rice Genome (Oryza sativa L. ssp. indica) Jun Yu et al. Science, 5 April 2002, p A Draft Sequence of the Rice Genome (Oryza sativa L. ssp. japonica) Stephen A. Goff et al. Science, 5 April 2002, p Miniature Genome in the Marine Chordate Oikopleura dioica Hee-Chan Seo et al. Science, 21 December 2001, p. 2506

23 23 Nature 431: 931 (2004) Genoma humano

24 24 Estratégias para Seqüenciamento de Genomas Shotgun: o genoma é fragmentado ao acaso em pedaços pequenos (2,0 – 4,0 kb) que se sobrepõem. Esses fragmentos dão clonados num plamídeo (pUC18). Um número suficiente de clones é seqüenciado para gerar um conjunto de seqüências que corresponde a várias vezes o genoma (aproximadamente 10X). As seqüências (reads) são montadas com auxílio de programas de computador em regiões genômicas completas. Clone a clone: um conjunto de clones de cada cromossomo ou região do genoma é organizado, cada clone é seqüenciado e as seqüencias de cada clone são montadas num segmento maior.

25 25 Shotgun Clone a Clone Estratégias para Seqüenciamento

26 26 Cobertura do genoma C= N.r/G C= cobertura do genoma N= número de reads r= tamanho médio dos reads G= tamanho do genoma Genome coverage: average number of times a nucleotide is represented by a high- quality base in random raw sequence. Full shotgun coverage: genome coverage in random raw sequence required to produce finished sequence, usually 8-10 fold. Partial shotgun coverage: typically 3-6X random coverage of a genome which produces sequence data of sufficient quality to enable gene identification but which is not sufficient to produce a finished genome sequence Contig: contiguous DNA sequence produced from joining overlapping raw sequence reads. Scaffold: a group of ordered and orientated contigs known to be physically linked to each other by paired read information. Finished sequence: complete sequence of a genome with no gaps and an accuracy of > 99.9%. C= 8X N= número de reads r= 400 bp G= 1 Mb 10=N.400/10 6 N=

27 27 Estratégia de seqüenciamento shotgun

28 28 Estratégia para Fechamento PACE - PCR-Assisted Contig Extension Carraro et al. BioTechniques 34: (March 2003)

29 29

30 30 Lab Bioinformática – LNCC Dra. Ana Tereza Vasconcelos

31 31 Diagrama mostrando as etapas de um projeto de seqüenciamento de genoma por shotgun. Fraser et al. (Nature 406, 799 – 803, 2000)

32 32 O genoma de H. inflluenzae tem 1,83 Mb e contém 1740 open reading frames (ORFs) O genoma de M. genitalium tem bp e contém 470 ORFs


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