Eletroforese.

Apresentação em tema: "Eletroforese."— Transcrição da apresentação:

1 Eletroforese

2 Eletroforese É um processo que consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico. É usado para separar e analisar biomoléculas. Princípio: Substâncias em solução que possuem carga elétrica livre, deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico de sentido invariável. Para que uma partícula se mova é necessário que possua carga elétrica livre, isto é, excesso ou diferença de elétrons. Portanto: - para o ânodo (+) dirigem-se os ânions - para o cátodo (-) dirigem-se os cátions

3 Eletroforese As moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a carga elétrica e a forma. Separa-se partículas de mesma carga, porém com quantidades diferente de carga. Tipos de eletroforese - Livre - Anticonvectante - Carga da partícula - Peso da partícula - pH (solução tampão)

4 Moléculas grandes migram lentamente, enquanto moléculas pequenas movem-se rapidamente.

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6 Eletroforese Suportes: Meio sólido: - Papel - Acetato de celulose
Meio semi-sólido: - Gel de amido - Gel de agarose - Gel de poliacrilamida

7 A técnica é tão sensível, que pode ser usada eficientemente para separar moléculas que diferem apenas muito sutilmente em suas cargas e/ou massas.

8 Eletroforese Marcadores de peso molecular são usados para estimar o tamanho das moléculas das amostras.

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10 Eletroforese: a concentração do gel
A concentração do gel definirá o tamanho dos poros a serem atravessados pelas moléculas em migração. Geis muito concentrados oferecerão maior resistência à migração das moléculas.

11 Eletroforese: a concentração do gel
O grau de cross-links pode ser controlado pela razão de bis-acrilamida (cross-linker) e acrilamida (que forma os polímeros lineares), determinando o tamanho dos poros do gel. 1 molécula de bis-acrilamida para cerca de 29 monômeros de acrilamida.

12 Preparo: pó de agarose e solução tampão (TBE).
Tipos de gel de eletroforese Gel de agarose É um polissacarídeo; forma uma rede que segura as moléculas durante a migração. Preparo: pó de agarose e solução tampão (TBE). Após fundir, coloca-se brometo de etídio, que fará o DNA ou RNA "brilhar" quando exposto ao UV. Coloca-se o pente no gel. O pente cria poços que serão utilizados para a aplicação das amostras.

13 Tipos de eletroforese Gel de poliacrilamida
Acrilamida e Bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, A bisacrilamida é em forma de "T". Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação.

14 Gel de poliacrilamida

15 Eletroforese capilar - Reduz o tempo de migração dos fragmentos de DNA substituindo a lâmina de gel por centenas de pequenos capilares (100 micra de diâmetro interno). - Aplicação de campos elétricos mais elevados para fazer com que os fragmentos se separem mais rapidamente. - O uso de um sistema de detecção através de fluorescência confocal, excitada por laser, torna possível a análise de mais de um capilar de cada vez. - Com a excitação e detecção confocal (uso de mesmos focos), em que a profundidade de campo do sistema ótico é suficientemente pequena para sondar apenas o interior de cada capilar, obtém-se alta resolução e eficiência de detecção.

16 Gel de eletroforese capilar
Neste novo sistema, uma guarnição de capilares é colocada em um suporte e, sob controle computadorizado, cada capilar vai sendo submetido à varredura do feixe de laser. Os fragmentos de DNA, marcados com corantes de alta fluorescência, emitem fluorescência, que é filtrada e detectada por um fotomultiplicador

17 Eletroforese Fatores que interferem na migração de partículas
- Mobilidade - Diâmetro - Peso molecular - Força iônica - Viscosidade - Endosmose

18 Eletroforese: saída de força
A saída de força pode ser de diversos tipos: - Voltagem constante (mV) - Corrente constante (ampéres) - Força constante (watts)

19 Eletroforese Proteínas: - aminoácidos como eletrólitos
Proteínas séricas: - Albumina - Globulinas (α1, α2, β, δ)

20 Eletroforese LipoProteínas – unidade de transporte lipídico
- Ultracentrifugação - Separação por eletroforese Identificação de 4 faixas lipoproteicas - Quilomicrons - Lipoproteína Beta - Lipoproteína Pré-beta - Lipoproteína Alfa

21 Eletroforese Hemoglobina - Hemoglobina anormais - Carga elétrica
- Ponto isoelétrico - Hemoglobina S - Hemoglobina C - Talassemia Beta

22 Eletroforese Hemoglobina S - Hemoglobinopatia estrutural
* substituição do ácido glutâmico pela valina - Indivíduos homozigotos (SS) - Anemia hemolítica congênita ( anemia falciforme) - Indivíduos heterozigotos (AS) - Traço siclêmico - Geralmente assintomáticos

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24 Eletroforese Hemoglobina C - Hemoglobinopatia estrutural
* substituição do ácido glutâmico pela lisina - Indivíduos homozigotos (CC) - Indivíduos heterozigotos (SC) - Anemia - Indivíduos heterozigotos (AC) - Raros sintomas clínicos - Detecção para aconselhamento genético

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26 Eletroforese Talassemia Beta
- Depressão parcial ou total na síntese de cadeias beta da hemoglobina A - Indivíduos homozigotos - Anemia hemolítica grave - Indivíduos heterozigotos - Podem ser: assintomáticos anemia hipocrômica e microcítica anemia hemolítica leve/ moderada

27 Eletroforese: métodos de leitura
Eluição

28 Eletroforese: métodos de leitura
Densitometria

29 OBRIGADA!!!