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1 Eletroforese. 2 É um processo que consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico. É usado para separar.

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1 1 Eletroforese

2 2 É um processo que consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico. É usado para separar e analisar biomoléculas. Princípio: Substâncias em solução que possuem carga elétrica livre, deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico de sentido invariável. Para que uma partícula se mova é necessário que possua carga elétrica livre, isto é, excesso ou diferença de elétrons. Portanto: - para o ânodo (+) dirigem-se os ânions - para o cátodo (-) dirigem-se os cátions

3 3 Eletroforese As moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a carga elétrica e a forma. Separa-se partículas de mesma carga, porém com quantidades diferente de carga. Tipos de eletroforese - Livre - Anticonvectante - Carga da partícula - Peso da partícula - pH (solução tampão)

4 4 Moléculas grandes migram lentamente, enquanto moléculas pequenas movem-se rapidamente.

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6 6 Eletroforese Suportes: Meio sólido: - Papel - Acetato de celulose Meio semi-sólido: - Gel de amido - Gel de agarose - Gel de poliacrilamida

7 7 A técnica é tão sensível, que pode ser usada eficientemente para separar moléculas que diferem apenas muito sutilmente em suas cargas e/ou massas.

8 8 Eletroforese Marcadores de peso molecular são usados para estimar o tamanho das moléculas das amostras.

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10 10 Eletroforese: a concentração do gel A concentração do gel definirá o tamanho dos poros a serem atravessados pelas moléculas em migração. Geis muito concentrados oferecerão maior resistência à migração das moléculas.

11 11 Eletroforese: a concentração do gel O grau de cross-links pode ser controlado pela razão de bis-acrilamida (cross-linker) e acrilamida (que forma os polímeros lineares), determinando o tamanho dos poros do gel. 1 molécula de bis-acrilamida para cerca de 29 monômeros de acrilamida.

12 12 É um polissacarídeo; forma uma rede que segura as moléculas durante a migração. Tipos de gel de eletroforese Gel de agarose Preparo: pó de agarose e solução tampão (TBE). Após fundir, coloca-se brometo de etídio, que fará o DNA ou RNA "brilhar" quando exposto ao UV. Coloca-se o pente no gel. O pente cria poços que serão utilizados para a aplicação das amostras.

13 13 Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação. Tipos de eletroforese Acrilamida e Bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, A bisacrilamida é em forma de "T". Gel de poliacrilamida

14 14 Gel de poliacrilamida

15 15 - Reduz o tempo de migração dos fragmentos de DNA substituindo a lâmina de gel por centenas de pequenos capilares (100 micra de diâmetro interno). - Aplicação de campos elétricos mais elevados para fazer com que os fragmentos se separem mais rapidamente. - O uso de um sistema de detecção através de fluorescência confocal, excitada por laser, torna possível a análise de mais de um capilar de cada vez. - Com a excitação e detecção confocal (uso de mesmos focos), em que a profundidade de campo do sistema ótico é suficientemente pequena para sondar apenas o interior de cada capilar, obtém-se alta resolução e eficiência de detecção. Eletroforese capilar

16 16 Gel de eletroforese capilar Neste novo sistema, uma guarnição de capilares é colocada em um suporte e, sob controle computadorizado, cada capilar vai sendo submetido à varredura do feixe de laser. Os fragmentos de DNA, marcados com corantes de alta fluorescência, emitem fluorescência, que é filtrada e detectada por um fotomultiplicador

17 17 Eletroforese Fatores que interferem na migração de partículas - Mobilidade - Diâmetro - Peso molecular - Força iônica - Viscosidade - Endosmose

18 18 Eletroforese: saída de força A saída de força pode ser de diversos tipos: - Voltagem constante (mV) - Corrente constante (ampéres) - Força constante (watts)

19 19 Eletroforese Proteínas: - aminoácidos como eletrólitos Proteínas séricas: - Albumina - Globulinas (α1, α2, β, δ)

20 20 Eletroforese LipoProteínas – unidade de transporte lipídico Identificação de 4 faixas lipoproteicas - Quilomicrons - Lipoproteína Beta - Lipoproteína Pré-beta - Lipoproteína Alfa - Ultracentrifugação - Separação por eletroforese

21 21 Eletroforese Hemoglobina - Hemoglobina S - Hemoglobina C - Talassemia Beta - Hemoglobina anormais - Carga elétrica - Ponto isoelétrico

22 22 Eletroforese Hemoglobina S - Indivíduos heterozigotos (AS) - Traço siclêmico - Geralmente assintomáticos - Hemoglobinopatia estrutural * substituição do ácido glutâmico pela valina - Indivíduos homozigotos (SS) - Anemia hemolítica congênita ( anemia falciforme)

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24 24 Eletroforese Hemoglobina C - Indivíduos heterozigotos (AC) - Raros sintomas clínicos - Detecção para aconselhamento genético - Hemoglobinopatia estrutural * substituição do ácido glutâmico pela lisina - Indivíduos homozigotos (CC) - Indivíduos heterozigotos (SC) - Anemia

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26 26 Eletroforese Talassemia Beta - Indivíduos heterozigotos - Podem ser: assintomáticos anemia hipocrômica e microcítica anemia hemolítica leve/ moderada - Depressão parcial ou total na síntese de cadeias beta da hemoglobina A - Indivíduos homozigotos - Anemia hemolítica grave

27 27 Eluição Eletroforese: métodos de leitura

28 28 Eletroforese: métodos de leitura Densitometria

29 29 OBRIGADA!!!


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