Cultura Celular a Curto Prazo BIO Citogenética Básica

Apresentação em tema: "Cultura Celular a Curto Prazo BIO Citogenética Básica"— Transcrição da apresentação:

1 Cultura Celular a Curto Prazo BIO1940 - Citogenética Básica
Dr. Cláudio C. Silva PUC-Goiás / BIO

2 Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Amostra Heparinizada Fitohemaglutinina Meio RPMI Glutamina Soro Fetal Bovino Antibióticos Cultura Celular

3 Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Preparação das Lâminas Colchicina Hipotônica Fixador Limpeza da lâminas Gotejamento da amostra Coloração com Giemsa 4%

4 Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Análise Microscópica

5 Protocolo de Cultura Celular
Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985) Protocolo de Cultura Celular Coleta das Amostras Sangue periférico Heparinizado ,0mL Meio RPMI ,5mL Glutamina ,1mL Soro Fetal Bovino ,0mL Fitohemaglutinina ,1mL Antibióticos ,1mL Incubar na estufa 37oC durante 47h; Acrescentar 10g/mL (100L) colchicina em cada cultura; Incubar por mais 1h (47h+1h=48h de cultura) Ao completar 48h de cultura fazer a colheita;

6 Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Transferir a amostra para um cubo cônico de centrífuga; Centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de solução hipotônica previamente aquecida de KCl a 0,075M; Colocar na estufa a 37oC por 15 minutos, centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de fixador de Carnoy´s gelado; Aguardar 10 minutos, centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; Repetir os dois últimos passos por mais duas vezes; Gotejar em uma lâmina limpa e desengordurada ± 3 gotas da amostra sob banho maria a 60oC e aguardar 1 minuto;

7 Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

8 Coloração e Análise das lâminas
Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985) Coloração e Análise das lâminas Mergulhar as lâminas em Giemsa à 4% durante 10 minutos; Enxaguar em água corrente; Secar e proceder a análise microscópica da amostra;

9 Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)
Observar em pequeno aumento para localizar as metáfases e depois em 1000X para a análise microscópica dos cromossomos; Análise Microscópica Microscópio Lâmina Coordenadas Número de cromossomos Observações Recomendações da SBG / 2004 Contagem: células Análise: 4-5 células Cariótipo: 2 células