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Cultura Celular a Curto Prazo BIO1940 - Citogenética Básica Dr. Cláudio C. Silva PUC-Goiás / BIO.

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1 Cultura Celular a Curto Prazo BIO Citogenética Básica Dr. Cláudio C. Silva PUC-Goiás / BIO

2 Cultura Celular Amostra Heparinizada Fitohemaglutinina Meio RPMI Glutamina Soro Fetal Bovino Antibióticos Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

3 Preparação das Lâminas Colchicina Hipotônica Fixador Limpeza da lâminas Gotejamento da amostra Coloração com Giemsa 4% Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

4 Análise Microscópica Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

5 Coleta das Amostras Protocolo de Cultura Celular Sangue periférico Heparinizado ,0mL Meio RPMI ,5mL Glutamina ,1mL Soro Fetal Bovino ,0mL Fitohemaglutinina ,1mL Antibióticos ,1mL Incubar na estufa 37 o C durante 47h; Acrescentar 10 g/mL (100 L) colchicina em cada cultura; Incubar por mais 1h (47h+1h=48h de cultura) Ao completar 48h de cultura fazer a colheita;

6 Transferir a amostra para um cubo cônico de centrífuga; Centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de solução hipotônica previamente aquecida de KCl a 0,075M; Colocar na estufa a 37 o C por 15 minutos, centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de fixador de Carnoy´s gelado; Aguardar 10 minutos, centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante; Repetir os dois últimos passos por mais duas vezes; Gotejar em uma lâmina limpa e desengordurada ± 3 gotas da amostra sob banho maria a 60 o C e aguardar 1 minuto; Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

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8 Coloração e Análise das lâminas Mergulhar as lâminas em Giemsa à 4% durante 10 minutos; Enxaguar em água corrente; Secar e proceder a análise microscópica da amostra; Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

9 Observar em pequeno aumento para localizar as metáfases e depois em 1000X para a análise microscópica dos cromossomos; MicroscópioLâminaCoordenadas Número de cromossomos Observações Análise Microscópica Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985) Recomendações da SBG / 2004 Contagem: células Análise: 4-5 células Cariótipo: 2 células


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