Elisa: quantificação de proteínas e moléculas

Apresentação em tema: "Elisa: quantificação de proteínas e moléculas"— Transcrição da apresentação:

1 Elisa: quantificação de proteínas e moléculas

2 Elisa: quantificação de proteínas e moléculas

3 Sistema Duplo-Híbrido de Levedura

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5 Sistema Híbrido-Simples: identificar proteínas que ligam ao DNA

6 Sistema Híbrido-Simples

7 Sistema Híbrido-Simples

8 Sistema Híbrido-Simples

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10 1. Reagents interacting with DNA*
(a) Alkylating agents: Dimethyl sulphate, Mitomycin C, Nitrogen and sulphur mustards (b) Intercalating agents: Acridine dyes, Actinomycins, Adriamycin, Anthracenes Benzpyrene, Ethidium bromide, Propidium diiodide (c) Intertwining agents Distamycin, Netropsin 2. Analogues of bases, Acyclovir ,Adenine /3‑1‑D‑arabinoside, Amethopterin Aminopterin, 2‑aminopurine, Aphidicolin, 8‑azaguanine, Azaserine 6‑azauracil, 2'azido‑2'‑deoxynucleosides, 5‑bromodeoxycytidine Cytosine /3‑1‑D‑arabinoside, Diazooxynorleucine, Dideoxynucleosides 5‑fluorodeoxycytidine, 5‑fluorodeoxyuridine, 5‑fluorouracil, Hydroxyurea 6‑mercaptopurine 3. Inhibitors of topoisomerases: Coumericin, Nalidixic acid, Novobiocin, Oxolinic acid 4. Inhibitors of cell division: Colcemid, Colchicine, Vinblastine , Vincristine 2nd messengers/inhibitors dibut cA/GMP: [active] 1mM, Sigma B1381 Ca ionophore: [active] 5mM, Sigma 7272 PMA: [active] 10mM, Froskolin: [active] 10mM, Protein synthesis inhibitors cycloheximide: [active] 20mM, Boe chloramphenicol: [active] 100mM, Sigma anisomycin: [active] 60mM, Sigma A9789

11 GFP: green fluorescent protein

12 Microscopia confocal: estudo das células vivas

13 Actina F nas células da pele do bulbo da cebola: transformação transiente utilizando
A actina fundida a proteína gfp Ela está presente nas invaginações e envolta do núcleo

14 Invaginações e dinâmica do núcleo

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16 Reconstrução tridimensional da topologia do retículo endoplasmático
Nas plantas transgênicas expressando gfp

17 Luciferinas

18 Luciferinas

19 Luciferinas

20 Luciferinas

21 Luciferinas

22 para fluorescencia:::
Planta transgênica Promotor da GA20 ox fundido ao gene da luciferina Pulverização com luciferina Câmera CCD para fluorescencia::: superimposição de imagens

23 Luciferinas: uso simultâneo de diferentes

24 Luciferinas: Uso

25 Luciferinas: Uso

26 Luciferinas: Uso

27 Aequoporina: Estudo das alterações na Concentração de cálcio
In vivo e em tempo real, Por um método não-destrutivo

28 Frio: “manchas” de aumento de calcio
em resposta a baixas temperaturas

29 Fluoróforos utilizados para medir a [Ca2+] intracelular
Tempo após redução do Ca2+ do meio e o citosólico e fechamento do estômato Fluoróforo indo-1 Fura2:::gradiente de Ca2+ citosólico:::abundância canais de calcio na extremidade Fluoróforos utilizados para medir a [Ca2+] intracelular Efeito Luz vermelha:::protoplasto de folha de trigo:::Fluro-3:::tempo após adição do fluoróforo Efeito do GA e do ABA nos níveis de Ca2+ em protoplastos da camada de aleurona da cevada Tipos: 1) Fuoróforos monovalentes (single-wavelenghth dyes): continuam a ter a fluorescência no mesmo comprimento de onda Fluorescência dependente da [fluoróforo]: determinação semi-quantititiva do Ca2+: Ex: fura-3 e “calcio-verde”:semi-quantitativos, precisam de luz de menor intensidade (menos dano) 2) Fuoróforos polivalentes (ratio dyes): mudam o comprimento de onda da fluorescência quanto excitados Fluorescência independente da [fluoróforo]: precisão na determinação do Ca2+: Ex: fura-2 e indo 1 (polivalentes):precisão na determinação do Ca2+: precisam maior intensidade luminosa (maior dano;experimentos mais curtos)

30 Confecção de Bibliotecas
Estudo da expressão diferencial dos genes: Confecção de Bibliotecas de Subtração

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33 Checando a eficiência da subtração

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35 Confirmando a presença de uma proteína em um compartimento citosólico

36 Hibridização in situ: FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
Mapeamento de genes Estudo da estrutura do cromossoma Estudos citogenéticos: translocação, recombinação, etc.

37 Manipulação de substâncias ativas “enjauladas” (caged)
Efeito da liberação do ABA “enjaulado” após microinjeção em células-guarda Manipulação de substâncias ativas “enjauladas” (caged) Manipulação de cálcio Enjaulado: calcio controla a orientação de crescimento do tubo polínico (crescimento só no ápice) Nucleotídeos Queladores Mensageiros secundários Peptídeos Canais de Ca2+ que Respondem ao IP3 no estômato, pólem, etc.

38 Formas de enjaular um peptídeo ou proteína

39 Outros sistemas modelos opcionais à Arabidopsis

40 Phiscomitrella

41 Phiscomitrella

42 Phiscomitrella

43 Phiscomitrella GFP-talina

44 Estudo da Estrutura de um promotor
1) Análise por deleção

45 Estudo da Estrutura de um promotor
2) Análise por mutagênese

46 Estudo da Estrutura de um promotor
3) Análise por transativação

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