A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

Elisa: quantificação de proteínas e moléculas. Sistema Duplo-Híbrido de Levedura.

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "Elisa: quantificação de proteínas e moléculas. Sistema Duplo-Híbrido de Levedura."— Transcrição da apresentação:

1 Elisa: quantificação de proteínas e moléculas

2

3 Sistema Duplo-Híbrido de Levedura

4

5 Sistema Híbrido-Simples: identificar proteínas que ligam ao DNA

6 Sistema Híbrido-Simples

7

8

9

10 Protein synthesis inhibitors cycloheximide: [active] 20mM, Boe chloramphenicol: [active] 100mM, Sigma anisomycin: [active] 60mM, Sigma A9789 2nd messengers/inhibitors dibut cA/GMP: [active] 1mM, Sigma B1381 Ca ionophore: [active] 5mM, Sigma 7272 PMA: [active] 10mM, Froskolin: [active] 10mM, 1. Reagents interacting with DNA* (a) Alkylating agents: Dimethyl sulphate, Mitomycin C, Nitrogen and sulphur mustards (b) Intercalating agents: Acridine dyes, Actinomycins, Adriamycin, Anthracenes Benzpyrene, Ethidium bromide, Propidium diiodide (c) Intertwining agentsDistamycin, Netropsin 2. Analogues of bases,Acyclovir,Adenine /3 1 D arabinoside, Amethopterin Aminopterin, 2 aminopurine, Aphidicolin, 8 azaguanine, Azaserine 6 azauracil, 2'azido 2' deoxynucleosides, 5 bromodeoxycytidine Cytosine /3 1 D arabinoside, Diazooxynorleucine, Dideoxynucleosides 5 fluorodeoxycytidine, 5 fluorodeoxyuridine, 5 fluorouracil, Hydroxyurea 6 mercaptopurine 3. Inhibitors of topoisomerases: Coumericin, Nalidixic acid, Novobiocin, Oxolinic acid 4. Inhibitors of cell division: Colcemid, Colchicine, Vinblastine,Vincristine

11 GFP: green fluorescent protein

12 Microscopia confocal: estudo das células vivas

13 Actina F nas células da pele do bulbo da cebola: transformação transiente utilizando A actina fundida a proteína gfp Ela está presente nas invaginações e envolta do núcleo

14 Invaginações e dinâmica do núcleo

15

16 Reconstrução tridimensional da topologia do retículo endoplasmático Nas plantas transgênicas expressando gfp

17 Luciferinas

18

19

20

21

22 Promotor da GA20 ox fundido ao gene da luciferina Pulverização com luciferina Planta transgênica Câmera CCD para fluorescencia::: superimposição de imagens

23 Luciferinas: uso simultâneo de diferentes

24 Luciferinas: Uso

25

26

27 Aequoporina: Estudo das alterações na Concentração de cálcio In vivo e em tempo real, Por um método não-destrutivo

28 Frio: manchas de aumento de calcio em resposta a baixas temperaturas

29 Fluoróforos utilizados para medir a [Ca 2+ ] intracelular Tipos: 1) Fuoróforos monovalentes (single-wavelenghth dyes): continuam a ter a fluorescência no mesmo comprimento de onda 2) Fuoróforos polivalentes (ratio dyes): mudam o comprimento de onda da fluorescência quanto excitados Fluorescência independente da [fluoróforo]: precisão na determinação do Ca 2+ : Ex: fura-2 e indo 1 (polivalentes):precisão na determinação do Ca2+: precisam maior intensidade luminosa (maior dano;experimentos mais curtos) Fluorescência dependente da [fluoróforo]: determinação semi-quantititiva do Ca 2+ : Ex: fura-3 e calcio-verde:semi-quantitativos, precisam de luz de menor intensidade (menos dano) Efeito Luz vermelha:::protoplasto de folha de trigo:::Fluro-3:::tempo após adição do fluoróforo Tempo após redução do Ca 2+ do meio e o citosólico e fechamento do estômato Fluoróforo indo-1 Fura2:::gradiente de Ca 2+ citosólico:::abundância canais de calcio na extremidade Efeito do GA e do ABA nos níveis de Ca 2+ em protoplastos da camada de aleurona da cevada

30 Estudo da expressão diferencial dos genes: Confecção de Bibliotecas de Subtração

31

32

33 Checando a eficiência da subtração

34

35 Confirmando a presença de uma proteína em um compartimento citosólico

36 Hibridização in situ: FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) Mapeamento de genes Estudo da estrutura do cromossoma Estudos citogenéticos: translocação, recombinação, etc.

37 Manipulação de substâncias ativas enjauladas (caged) Nucleotídeos Queladores Mensageiros secundários Peptídeos Canais de Ca 2+ que Respondem ao IP3 no estômato, pólem, etc. Manipulação de cálcio Enjaulado: calcio controla a orientação de crescimento do tubo polínico (crescimento só no ápice) Efeito da liberação do ABA enjaulado após microinjeção em células-guarda

38 Formas de enjaular um peptídeo ou proteína

39 Outros sistemas modelos opcionais à Arabidopsis

40 Phiscomitrella

41

42

43 GFP-talina

44 Estudo da Estrutura de um promotor 1) Análise por deleção

45 Estudo da Estrutura de um promotor 2) Análise por mutagênese

46 Estudo da Estrutura de um promotor 3) Análise por transativação

47


Carregar ppt "Elisa: quantificação de proteínas e moléculas. Sistema Duplo-Híbrido de Levedura."

Apresentações semelhantes


Anúncios Google