Graziele Fonseca de Sousa

Apresentação em tema: "Graziele Fonseca de Sousa"— Transcrição da apresentação:

1 Graziele Fonseca de Sousa

2 Gene ERBB25 Codifica o receptor tipo 2 do fator de crescimento epidérmico humano(HER2) Cerca 20% -30% das mulheres com câncer de mama apresentam amplificação de ERBB2

3 HER2 biomarcador para o câncer de mama
A tirosina quinase desempenha um papel fundamental na regulação dos processos como o crescimento celular, sobrevivência e diferenciação.

4 Trastuzumab A Trastuzumab é potencialmente nocivo para os pacientes sem a produção de HER2, porque ele utiliza o mesmo receptor encontrado em tecido cardíaco não patológico, podendo causar cardiotoxicidade e em alguns casos, morte.

5 Porque utilizar os ensaios de FISH e IHQ?
São métodos comumente utilizados para a avaliação de superprodução da proteína ou amplificação do gene em relação as características morfológicas tumorais; Ao contrário das técnicas moleculares, não requer homogeneização do tumor; No entanto os resultados de aproximadamente 20% dos testes de HER2 realizados no departamentos de patologia nos locais de tratamento primário mostraram-se incorretos quando as amostras eram  reavaliadas em um alto volume no laboratório central.

6 Objetivos Gerar a produção de materiais de referência para estudar a utilização do IHQ e FISH para quantificação e caracterização das linhas celulares SKBR-3 e MCF-7 de carcinoma de mama HER2 em termos de produção e amplificação de ERBB2, respectivamente, e para examinar a adequação destas linhas celulares como controles para os teste de HER2.

7 Materiais e Métodos Linhas celulares de carcinoma de mama SK-BR-3 e MCF-7; Anticorpo anti-HER2 IgY de frango; Anticorpo monoclonal anti-HER2 IgG de camundongo; Anticorpos secundários, anti-IgY biotinilada (Genway Biotech) e anticorpo anti- IgG biotinilada (Ventana); Sonda de DNA para o gene ERBB2 foi a BAC; Os anticorpos e a sonda foram detectados por microscopia de fluorescência com estreptavidina-Qdot 655 (Invitrogen) como o reagente de detecção final de afinidade.

8 Imunohistoquímica ( IHQ)
O anticorpo conjugado a uma enzima, pode catalisar uma reação que produzirá coloração.

9 Hibridização Fluorescente In Situ (FISH)

10 Resultados

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13 Para os experimentos FISH em células FFPE, foi utilizado o sonda da HER2 Ventana em vez do sonda BAC CTD-2019C10 usado para células cultivadas fixas e foi utilizado o corante orgânico fluoresceína isotiocianato como o rótulo em vez de Qdot 655.

14 Discussão Seleção de pacientes para terapia:
Negativo Tratamento adequado Teste deHER2 Trastuzumab Positivo Imprecisão observada na prática clínica e em ensaios clínicos: Falta de padrões de referência; Falta do uso de calibradores do ensaio.

15 Acreditasse que os materiais de referência ideais para padrões e calibradores em testes de HER2 (bem como outros biomarcadores) possam ser as linhas celulares. As linhas de células podem ser cultivadas em vitro; Podem ser fixadas e processadas de maneira semelhantes aos das amostras histopatológicas; Obtenção de um duradouro banco de material de controle, fornecendo assim a reprodutibilidade e coerência entre os diferentes ensaios. A utilização de materiais com base em células de referência será útil para ambos os teste IHQ e FISH.

16 Sistema de utilização de 2 linhas de células
contêm aproximadamente 10x mais cópias do gene ERBB2 e cerca de 15x mais quantidade da proteína HER2 SK-BR-3 Sistema de utilização de 2 linhas de células MCF-7 FISH E IHQ Utilizado como controle devido ao pequeno número de cópias de ErbB2 em nestas células. Caracterização da produção da proteína HER2 e a amplificação do geneERBB2

17 Conclusões Demonstraram que SK-BR-3 e MCF-7 são candidatos adequados como materiais de referência para o teste HER2. Acoplado com as plataformas de ensaio associados, eles fornecem valiosos controles quantitativos para a medição de amplificação de HER2 no câncer de mama e de produção nas amostras, independentemente do anticorpo/ sonda ou detector usado.