Introdução ao PCR Reação da Polimerase em Cadeia

Apresentação em tema: "Introdução ao PCR Reação da Polimerase em Cadeia"— Transcrição da apresentação:

1 Introdução ao PCR Reação da Polimerase em Cadeia
Outubro de 1985 (idéia em 1983) American Society of Human Genetics criado por Kary B. Mullis

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3 Características do PCR
Amplificação de Seqüências Processo Cíclico 15 a 40 ciclos realizado por mudança de temperatura

4 Produção de DNA por PCR Produção de 2 a 4 mg DNA em 1-3 hs
específico = amplifica sequência-alvo na presença de DNA genômico sensível = detecta até apenas 1 sequência de molde flexível = muitas variações da técnica básica de PCR

5 Requerimentos Básicos do PCR
1. Molde - DNA ou RNA 2. DNA polimerase 3. dNTPs 4. Iniciadores de Oligonucleotídeos (Primers)

6 Função dos Iniciadores Primers
fornecer grupo 3’ OH para iniciação de síntese de DNA definir os limites do segmento de DNA-alvo a ser amplificado estabelecer especificidade

7 Função dos Primers

8 Oligos Iniciadores Primers
sintetizados quimicamente tipicamente entre 15 a 25 bases define limites de alvo a amplificar prévio conhecimento da sequência alvo tradução reversa de uma sequência de PTN primer de seqüências aleatórias

9 Ciclos de Temperatura no PCR
Anelamento do Primer Tm Desnaturação Extensão 94oC do Primer 72oC

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11 Desnaturação do DNA 94 a 100oC
desnaturar DNA alvo desnaturar produtos de ciclos prévios 4 a 10 min de desnaturação inicial duração de 30 s a 1 min

12 Anelamento do Primer 40 a 70oC
temperatura de “hibridização” otimização da temperatura para cada par de primer composição = %G+C Tm = (log10([M Na+])) *(%GC) - 600/length determina especificidade do produto amplificado tipicamente 30 s a 2 min

13 Anelamento do Primer %G+C
Tm = 81,5o + 16,6 * (log10([M Na+])) + 0,41*(%GC) - 600/comprimento [Na] em concentração Molar {PCR usa-se KCl} %GC em percentual comprimento em bases Primer /length GCG - 674/length formamida: subtrair 65*(% formamida) Primers > 10 bases em 0,05 M sal (PCR) Tm = 59, *(%GC) - 675/comprimento

14 Extensão do Primer 72oC Taq polimerase
faixa de atividade: 20oC a 85oC atividade varia 100x nessa faixa Tempo de extensão varia de acordo com tamanho do produto desejado

15 Exponencialidade do PCR
Caso ideal: N = No 2n N = número de moléculas amplificadas No = número inicial de moléculas n = número de ciclos de amplificação

16 Amplificação Geométrica
Ciclo Número Fita Duplas produzidas

17 PCR

18 Cinética do PCR Fase inicial (screening) Fase exponencial
Primers procuram o DNA molde com sequências complementares (como sondas) Primers em considerável excesso. Fase exponencial acúmulo exponencial do fragmento de DNA várias cópias das sequências alvos Fase tardia ou plateau amplificação já é sub-ótima

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20 Efeito “Plateau” Desvio do ideal teórico
reassociação do produto compete com anelamento do primer polimerase torna-se limitante – perda de atividade acúmulo de inibidores da polimerase (pirofosfato) Limitação de outros componentes Competição entre produtos Pareamento produto x molde - amplificação não específica

21 DNA molde número de cópias tipicamente 105 a 106 moléculas-alvo
Quantidade de DNA = equivalente a 3 x 105 cópias FONTE Genoma Haplóide (pb) Quantidade Humano x mg Levedura x ng E.coli x ng plasmídeo x pg

22 DNA molde Número de cópias DNA genômico: 50 a 250 ng
1 mg de DNA genômico humano = 3 X 105 moléculas de um gene único O mesmo número de moléculas está presente em: 10 ng de DNA genômico de levedura 1 ng de DNA genômico de E. coli 1-2 pg de plasmídeo 2 pg de bacteriofago l

23 Taq DNA Polimerase Proteína de 94 kDa Temperatura ótima: 75 a 80oC
Termoestabilidade limitada Ausência de função de edição sem exonuclease 3’ para 5’ Concentração de enzima = 1 a 2,5 U / 100 mL

24 Efeito da Temperatura na Taxa de Síntese de DNA
Temperatura Taxa de Síntese (nucleotídeos /seg) 22oC ,25 37oC ,5 55oC 70oC > 60 75oC > 150

25 Estabilidade da Taq sob Altas Temperaturas
Temperatura T 1/2 (minuto) 92,5oC 95,0oC 97,5oC

26 Frequência de Erro de DNA Polimerases Termoestáveis
Enzima Taxa de Mutação por 10-6 inserções de base Taq Vent (NEB)

27 Fatores Promotores da Fidelidade da Taq e Especificidade dos Primers
baixar a concentração de dNTPs (menos 200 mM) concentração de Mg++ - inversa/

28 [Magnésio] Concentração de Mg2+ afeta: Especifidade da reação
anelamento dos primers temperatura de desnaturação do DNA molde e dos produtos amplificados Especifidade da reação Formação de dímeros de primers Atividade e fidelidade da enzima Usualmente – inicia com 1,5 mM

29 Considerações na Seleção de Primers
Especificidade: primer deve formar duplex estável no sítio alvo específico Primer não forma duplex estável com si próprio ou com o outro primer Primer não possui sítios falsos no DNA alvo

30 Estabilidade dos Primers
Comprimento - número de bases Relação GC/AT Temperatura de desnaturação Tm análises do vizinho mais próximo energia livre de formação de duplex

31 Tm x GC%

32 Critérios para desenho de primers
Composição de bases: GC% = 40 a 60% distribuição homogênea ao longo do primer Comprimento: 18 a 25 bases do primer complementar ao molde Ambos primers = mesmo comprimento (até 3 bases)

33 Critérios para desenho de primers
Seqüências repetidas ou auto-complementares: Sem repetições invertidas no primer ou seqüências auto-complementares com + 3 bases seguida Complementaridade entre par de primers: 3’ de primer não pode ligar a qualquer ponto do outro primer Primers presentes em alta concentração e formação de híbridos com amplificação de dímeros de primers

34 Temperatura de fusão: O Tm calculado dos dois membros do par de “primers” não deve diferir em mais que 5oC O Tm do produto amplificado não deve diferir dos valores de Tm dos “primers”em mais que 10oC.

35 Temperatura de Separação de Duplexes de DNA
Tm = 81,5 + 16,6 log [Na+] + 0,41 (%G + %C) - 0,65 (% formamida) - 675/comprimento - % erro de pareamento

36 Especificidade dos Primers
Teoricamente 15 bases estabelecem especificidade 1/4 15 = 1,1 x 10 -9 Famílias de genes relacionados Duplicações assume toda sequência do primer envolvida seleção de sítio-alvo

37 Problemas comuns no Desenho de Primers
Auto-complementariedade Complementariedade entre primers Establidade térmica excessiva

38 Auto Complementariedade
Formação de alça GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT HOTGACTTC Tm = 71oC ACTGAA

39 Auto Complementariedade
Formação de alça sem problema GAACTACCTACGAAGATACTTCAGTOH Tm = 24oC CTTC GAAG

40 Complementariedade entre Primers
Formação de “primer dimer” 5’ GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH 5 ‘ CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGTOH OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH

41 Excesso de Estabilidade Térmica em 3’OH
TTTACTTAGTCGGACGCGGC OH CGCGGC OH GCGCCG Extremidade 3’ crucial = preferir 3’ como G ou C. Não recomendável que seja ...NNGG ou ...NNCC -> gerar dímeros de primers

42 - sítio para enzima de restrição, mais 3 a 4 bases adicionais
A extremidade 5’ não precisa ser complementar à seqüência alvo = permite adicionar seqüências com propósitos específicos na extremidade 5’ - sítio para enzima de restrição, mais 3 a 4 bases adicionais - promotores para transcrição in vitro - promotores de seqüências consenso para inicío de tradução para transcrição e tradução in vitro Para o cálculo do Tm considera-se apenas a região complementar à seqüência alvo.

43 Primers com sítios para enzimas de restrição:

44 Estabilidade Interna Melhores primers possuem terminal 5’ estável e terminal 3’ instável reduz pareamento falso Baixa estabilidade 3’ previne a formação de DNA duplexes que podem iniciar a síntese de DNA terminal 5’ deve parear para formar duplex estável

45 Mal-pareamento pré-PCR
Causas: DNA fita simples complexo na amostra molde mistura de reação completa incubada a temperatura com atividade da Taq Solução - “Hot Start”

46 Prevenção de Mis-priming
PCR Convencional Mix de reação completo 20 a 25 oC Transferir para termociclador Ciclos Produto amplificado

47 PCR “Hot Start” Mix de reação completo 20 a 25 oC
Transferir para termociclador desnaturação 100 oC manter a 80 oC Adicionar Taq polimerase Ciclos Produto amplificado

48 Enzimas para “Hot-Start”
AmpliTaq Gold enzima recombinante forma inativada - ativação 10 min 94oC Platinum Taq Polymerase ligação com inibidor termolábil contendo anticorpo monoclonal

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52 http://www-genome. wi. mit. edu/cgi-bin/primer/primer3_www

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54 Parâmetros dos ciclos:
1. Temperatura e Tempo de desnaturação Falta de desnaturação da template é uma causa comum de falha na PCR Tipicamente 94oC por 30 s Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida da enzima

55 Parâmetros dos ciclos:
2. Temperatura e Tempo de anelamento Temperatura de anelamento = 5oC abaixo do Tm real dos primers Tempo de anelamento = 15 a 30 s Tempo de extensão função tamanho do AMPLICON 1 minuto é suficiente 1,2 kb Longo reduz a meia vida da enzima

56 A Tm do produto amplificado não deve exceder ~85oC.
Temperatura de desnaturação em PCR é definida como a temperatura na qual há separação irreversível das fitas de uma população homogênea de moléculas. A temperatura de separação irreversível das fitas é vários graus acima do Tm (tipicamente, 92oC para DNA com 50% de G+C).

57 DNA Polimerases Sintetizam uma fita nova de DNA extendendo um primer pela incorporação de NTPs na direção 5’ -> 3’ tendo como orientação a informação contida na fita molde (template).

58 DNA Polimerases As DNA polimerases normalmente têm também atividade exonuclease 3’ -> 5’ = atividade proof reading 5’ -> 3’ = atividade corretiva necessidade de remoção de um segmento de DNA que está a frente da enzima

59 DNA Polimerases Termoestáveis
Thermos aquaticus (Taq polymerase) 1ª descoberta e + usada Síntese 5’-> 3’ / Exonuclease 5’-> 3’ Thermus thermophilus (rthpol) a = similar à subunidade da DNA pol-III de E. coli. rTth pol atividade de transcriptase reversa na presença de Mn2+ DNA polimerases adicionam base a mais na 3’ > adição > [Mg2+] e de [enzima]. A base a mais adicionada é quase sempre A

60 DNA Polimerases Termoestáveis
Thermos aquaticus (Taq polymerase) Taxa de incorporação de bases erradas pode variar entre 10-3 a 10-6, dependendo das concentrações de Mg2+ e dNTPs A incorporação de base errada (mismatch) reduz a estabilidade da interação da enzima com o DNA, favorecendo a interrupção da polimerização. Baixa temperatura de extensão e elevada concentração de dNTPs favorecem a extensão de primers com pareamento imperfeito e a extensão após mismatch.

61 DNA Polimerases Termoestáveis
Pyrococcus furiosus (Pfu) - com 2 subunidades codificadas por 2 genes de único operon Forte atividade exonuclease 3’->5’ (atividade proof reading) Enzimas com atividade proof reading não adicionam A na extremidade 3’OH, independentemente do molde

62 DNA Polimerases Termoestáveis
Polimerases com função corretiva Pyrococcus furiosus (Pfu) Thermoccocus litoralis (Tli) Promega Vent DNA polymerase = Tli recombinante New England Biolabs Atividade exonucleásica 3’-> 5’ Mais termoestáveis que a Taq Meia vida de 6,7 h a 95oC) Sintetizam fragmentos de até 13 kpb.

63 Variações de Taq polymerase
AmpliTaq: Taq polimerase produzida em E. coli. Reprodutibilidade maior que enzima nativa [Applied Biosystems] AmpliTaq Gold: forma modificada da AmpliTaq fornecida em forma inativa. Requer aquecimento a oC por 10 min para ser ativada Stoffel fragment: forma amputada da Taq sem 289 amino ácidos terminal N, sem atividade exonuclease 5’ --> 3’. Cerca de 2 vezes mais termoestável que a Taq [Applied Biosystems]

64 Variações de Taq polymerase
Taq 2000 : Taq recombinate altamente purificada [Stratagene] AdvanTaq: sem amino ácidos N-terminais com maior termorresistência, melhor atividade em faixa ampla de [Mg] e maior afinidade pelo molde – uso concentração de DNA alvo muita baixa [Clontech] AGSGold DNA polymerase: maior capacidade de síntese de DNA (3 vezes mais produto que a Taq) [Hybaid]

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66 PCR de longa distância Mistura de enzimas = melhor que uma única enzima para amplificar fragmentos longos KlenTaq / Pfu (ex.: 160:1 a 640:1) Taq / Pfu Existem várias misturas disponíveis comercialmente Elongase (Invitrogen) Expand DNA Polymerase (Boehringer) Advantage (Clontech)

67 Modelo de funcionamento da mistura de enzimas Elongase (Invitrogen)
Taq/Pfu

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