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RODRIGO ROCHA LATADO. 2 PRINCIPAIS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS.

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Apresentação em tema: "RODRIGO ROCHA LATADO. 2 PRINCIPAIS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS."— Transcrição da apresentação:

1 RODRIGO ROCHA LATADO

2 2 PRINCIPAIS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

3 3 MICROPROPAGAÇÃO DE PLANTAS

4 4 PROPAGAÇÃO DE PLANTAS Semente (via sexuada): espécies com poucas sementes espécies sem sementes perda da germinação progênie heterogênea Vegetativa (via assexual) in vivo: estaca, enxertia, borbulha processo lento propagação de doenças sazonalidade espaço físico in vitro: meristema apical segmento nodal estímulo a gemas axilares

5 5 MICROPROPAGAÇÃO: propagação clonal de genótipos selecionados, utilizando técnicas de cultura de tecidos, visando a produção de plantas em massa, a um preço competitivo uso de explantes com meristemas pré-existentes meristema apical: dome com células totipotentes divisão constante não tem conexão com xilema e floema ápice meristemático: dome meristemático + primórdios foliares Vantagens: > número de mudas rapidez rejuvenescimento livre de doenças espaço físico reduzido sazonalidade Desvantagens: variação somaclonal contaminação aclimatização custo protocolo

6 6 meristema x ápice meristemático

7 7 MICROPROPAGAÇÃO: descoberta das citocininas descrição do meio MS EXPLANTES ápice meristemático segmento nodal: alongamento de ramo com vários nós proliferação de gemas axilares: quebra de dominância apical brotos axilares são explantes secundários para próximos ciclos Principais culturas: Banana, Cana-de-açúcar, Eucalipto, Pinus, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais

8 8 ETAPAS DA MICROPROPAGAÇÃO Introdução do explante Indução de brotações Aclimatização das plantas Alongamento, desenvolvimento e enraizamento das plantas in vitro

9 9 Micropropagação de baunilha Micropropagação de mandioca

10 10 MICROPROPAGAÇÃO Estádio 0: seleção da planta matriz sanidade estádio fisiológico estado nutricional Estádio 1: estabelecimento da cultura asséptica e viável época de retirada do explante posição do explante na planta matriz baixa [ ] de citocinina; baixa [ ] de auxina Estádio 2: multiplicação alta [ ] de citocinina números de subcultivos Estádio 3: alongamento e enraizamento ácido giberélico, auxinas (IBA, NAA) Estádio 4: aclimatização controle de umidade e luz

11 11 MICROPROPAGAÇÃO Meio de Cultura Sólido: ágar, gel melhor aeração absorção de nutrientes é deficiente Meio de Cultura Líquido: estacionário, agitação maior disponibilidade de nutrientes maior disponibilidade de água oxigenação suporte: papel de filtro, espuma Imersão Temporária: alternância de meio de cultura líquido com ausência de meio de cultura melhor aeração maior contato com meio de cultura ex. banana (20min. / 2h)

12 12 CULTIVO DE MERISTEMAS PARA LIMPEZA DE VÍRUS

13 13 LIMPEZA DE VÍRUS Doenças de Plantas: fungos, bactérias, vírus transmitidas na propagação vegetativa White (1934): vírus estão distribuídos de maneira desuniforme em raiz de fumo redução da concentração em direção à extremidade ápice radicular livre de vírus Limasset & Cormet (1949): gradiente de concentração de vírus na parte aérea Morel & Martin (1952): plantas de dália livres de vírus

14 14 LIMPEZA DE VÍRUS - Sequência Principais culturas: Cana-de-açúcar, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais

15 15 LIMPEZA DE VÍRUS - Sequência

16 16 LIMPEZA DE VÍRUS termoterapia + cultura do ápice meristemático ex: vírus do mosaico da cana-de açúcar cultura de meristema: explante 0,3 mm cultura ápice meristemático (1 – 2,5 cm) + termoterapia (45 o C / 8 horas) quimioterapia + cultura do ápice meristemático incorporação de antivirais no meio de cultura Indexação: avaliação da presença do vírus ensaios biológicos microscopia eletrônica serologia (ELISA) hibridação com ácido nucleico

17 17 CULTURA DE CALOS

18 18 CULTURA DE CALOS FASES 1. ASSEPSIA 2. EXPLANTES (discos de folhas, raiz, caule, sementes, etc...) 3. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO - INDUÇÃO DE CALOS (geralmente meio contendo auxinas) Calos em citros (meio contendo BAP) 4. DESDIFERENCIAÇÃO CELULAR - retorno das células ao estado meristemático Depende de: competência e habilidade para responder ao estímulo

19 19 CULTURA DE CALOS 5. SUBCULTIVOS MENSAIS - mesmo meio de indução - outros meios 6. DIFERENCIAÇÃO CELULAR- utilizando uma das duas vias, - Organogênese somática - Embriogênese somática 7. REGENERAÇÃO DE PLANTAS 8. ACLIMATIZAÇÃO AO MEIO AMBIENTE

20 20 CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO

21 21 CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO FASES 1. EXPLANTES (calos - células meristemáticas, alta taxa de divisão celular) 2. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO LÍQUIDO - geralmente no mesmo meio de cultivo de calos 3. AGITAÇÃO CONSTANTE (100 rpm) E ESCURO - oxigenação do meio 4. SUBCULTIVOS SEMANAIS OU QUINZENAIS - duplica ou triplica o volume celular em 7 dias

22 22 CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO SELEÇÃO in vitro - adição de agentes seletivos: herbicidas, toxinas purificadas, NaCl (sal), alumínio, PEG (seca) e outros 5. ALTA TAXA DE CONTAMINAÇÃO - motivo: meio líquido 6. TRANSFERÊNCIA PARA MEIO SÓLIDO - obtenção de calos 7. REGENERAÇÃO DE PLANTAS 8. ACLIMATIZAÇÃO AO MEIO AMBIENTE

23 23 CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO Células Células em meio contendo alta osmolaridade Células em suspensão Agitador orbital

24 24 CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES

25 25 CULTURA DE CÉLULAS HAPLÓIDES FASES 1. ASSEPSIA 2. EXPLANTES (anteras (micrósporo), pólen, óvulos, ovários vegetais) 3. INTRODUÇÃO AO MEIO DE CULTIVO (pré-tratamento) 4. INDUÇÃO DE ORGANOGÊNESE OU ÊMBRIOGÊNESE - direta (sem passar pela fase de calos) - indireta (com passagem pela fase de calos) Depende de: competência e habilidade para responder ao estímulo

26 26 CULTURA DE PLANTAS HAPLÓIDES FASES 5. DESENVOLVIMENTO DAS PLANTAS in vitro - alongamento das plantas - enraizamento - aclimatização 6. OBTENÇÃO DE PLANTAS HAPLÓIDES OU DUPLO-HAPLÓIDES - duplicação cromossômica natural ou com utilização de drogas antimitóticas - drogas (colchicina, oryzalina, hidroxiquinolina, etc... )

27 27 CULTURA DE PLANTAS HAPLÓIDES FlorAnteras Micrósporo germinando Embriogênese somática Multiplicação Aclimatização

28 28 CULTURA DE PLANTAS HAPLÓIDES Flor - OvárioÓvulos Calos Organogênese somática Obtenção de plantas Multiplicação

29 29 CULTURA DE PROTOPLASTOS VEGETAIS

30 30 CULTURA DE PROTOPLASTOS - Células vegetais isoladas e sem parede celular (removidas por enzimas) Enzimas Hemicelulases - digerem hemicelulose Celulases - digerem celulose Pectinases - digerem pectinas - sensíveis a modificação na osmolaridade do meio e a luz - meio mais concentrado protoplastos perdem água para o meio - meio mais diluído protoplastos absorvem água do meio meios geralmente entre 0,4 e 0,8M

31 31 CULTURA DE PROTOPLASTOS - usam manitol ou sacarose para ajustar a osmolaridade do meio - A ausência de parede celular possibilita a fusão de protoplastos - Isolamento, purificação e cultivo de protoplastos utilizando meios contendo a mesma osmolaridade MEIOS Meios CPW - Cell Protoplast Wash, MS 0,4M e MS 0,4M (2X) Solução de enzimas 0,4M Solução de Polietileno glicol a 50% Agarose tipoVII (baixo ponto de fusão) - 1,2%

32 32 MEIO CPW (para protoplastos vegetais ( Gilmour et al., 1989) Composição mg/L 1. CaCl 2 *2H 2 O MgSO 4 *7H 2 O KNO KH 2 PO 4 27,2 5. KI 0,16 - acrescentar Manitol para o controle da osmolaridade (0,4 M) - ajustar o pH 6,0 - esterilizar SOLUÇÕES ESTOQUE CONC. VOLUME USADO / L A. CaCl 2 *2H 2 O 50x 20 mL/L B. OUTROS SAIS 100x 10 mL/L

33 33 CULTURA DE PROTOPLASTOS Material esterilizado - placas de Petri - peneiras com poros de 50 m - tubos 8 ml com tampa - pipetas Pasteur

34 34 CULTURA DE PROTOPLASTOS FASES 1. EXPLANTES - (folhas, calos, suspensão celular, pétalas, anteras) 2. ISOLAMENTO DOS PROTOPLASTOS - Agitação 50 rpm, escuro, 27 o C, durante 8 a 16 h. 3. PURIFICAÇÃO - peneiramento, centrifugação, retirada da solução, lavagem com CPW 4. FUSÃO - adição de PEG ou eletrofusão 5. RETIRADA DO PEG 6. CULTIVO DOS PRODUTOS DA FUSÃO - meio MS 0,4M(2X) e agarose

35 35 CULTURA DE PROTOPLASTOS ExplanteProtoplastos Viabilidade de protoplastos Fusão Fusão múltipla

36 36 CULTURA DE PROTOPLASTOS Primeira divisão Microcalo Microcolônia Calos e embriões somáticos Embrião somático Embrião germinando

37 37 CULTURA DE PROTOPLASTOS Plantas in vitro Placa com embriões germinando Desenvolvimento das plantas e enraizamento Aclimatização ao meio ambiente


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