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EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE RNA Ma. Lorena Sereno Antonio Figueira 2008

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Apresentação em tema: "EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE RNA Ma. Lorena Sereno Antonio Figueira 2008"— Transcrição da apresentação:

1 EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE RNA Ma. Lorena Sereno Antonio Figueira 2008
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2 INTRODUÇÃO RNA = ácido ribonucléico: Açúcar = Ribose
Polímero de Ribonucleosídeos fosfatados Açúcar = Ribose Bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina, Uracila Timina, Pseudouridina, Citosina/Guanina metiladas Tipos variáveis Funções celulares diversas Tipos variáveis Funções celulares diversas

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4 TIPOS / FUNÇÕES do RNA “Populares”
Atividade transcricional do genoma humano “Populares” RNA mensageiro (mRNA) = cópia temporária de genes para síntese de proteínas RNA de transferência (tRNA) = adaptador para decodificação do código genético RNA ribossômico (rRNA) = catálise da síntese de proteínas

5 Hipótese do início da vida (“RNA world”)
Genomic loci mRNA, transp, virus, heterocromatin Funções = regulação e catálise de ácidos nucléicos (auto-processamento) Hipótese do início da vida (“RNA world”) Único polímero biológico capaz de realizar catálise (~proteína) e armazenar informação (~DNA)

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8 ESTRUTURA dos RNAs ESTRUTURA - FUNÇÃO Difração de Raios X
Ressonância Magnética Nuclear Modelagem Teórica Computacional (base experimental) SEQUENCIAMENTO Probabilidade de dobramento Pareamento de bases Viabilidade energética ESTRUTURA - FUNÇÃO

9 Estrutura dos RNAs Exemplos (3D): mRNA viral associado a proteína
mRNA viral indutor de tumor

10 Estrutura dos RNAs Exemplos: tRNA – Phe de levedura rRNA 5S

11 Estrutura dos RNAs Exemplos: RNA dupla hélice snRNA Okazaki

12 Extração de RNA: Teoria da Prática
Células Procarióticas/Eucarióticas complexidade química integridade das moléculas de RNA (instável ex vivo) Objetivos separar os ácidos nucléicos dos demais componentes celulares separar RNA do DNA contaminante (pureza) manter a integridade molecular do RNA (informação) Tecidos Vegetais polissacarídeos compostos fenólicos e oxidativos nucleases (RNAses) todos os organismos!

13 Extração de RNA - Métodos
SDS, CTAB, Trizol, Tris, EDTA, PVP, Mercaptoetanol, Guanidina-tiocianato Lise Celular Separação dos Componentes Celulares TRIZOL, Fenol, Guanidina tiocianato, Clorofórmio, Álcool Isoamílico DEPC Precipitação de RNA Isopropanol , Etanol, LiCl Lavagem de RNA Etanol 75% Ressuspensão ddH2O-DEPC

14 Preparo de material livre de RNAse
Luvas de látex descartáveis Materiais plásticos descartáveis (tubos e ponteiras) Pipetadores automáticos exclusivos Cadinhos e pistilos : solução de 0,01 % SDS (p/v), água destilada, água ultrapura (milliQ) incubados com água 0,01% de dietilpirocarbonato (DEPC) ativo (2h) autoclavados (120C) /20 min - estufa (80C) Soluções de trabalho: preparadas com água 0,01% DEPC autoclavada. Cubas de eletroforese e pentes: lavar com 0,01% SDS e enxaguar água livre de RNAse (água DEPC) Vidraria idem - autoclave Alternativa/: 150ºC por 4 h ou Peróxido de hidrogênio 3%-15 min ou 10 min. 0,5 M NaOH

15 Extração de RNA - Análise
Integridade Eletroforese em gel de agarose 1,0-1,4 % (2-3 V/cm) Gel desnaturante (pre trat RNA) / não-desnaturante Bandas de rRNA visíveis e com intensidade proporcional (brometo de etídeo ou SYBR green) “smear” de mRNA (?) 28S 18S 5S

16 massa de RNA / massa da amostra
Rendimento e Pureza (métodos) massa de RNA / massa da amostra Quantificação: leitura da absorbância a 260 nm (espectrofotômetro) 1,0 unidade A260 ssRNA = 40 g/ml A260 /A280 ~ 1,8 (sem contaminação por proteínas e fenóis) A280 = proteínas; A260 =DNA A230 = polissacarídeos; contaminantes orgánicos A320 = background (impurezas) ... Prática! Bandas ribossômicas: 28S:18S = 2,0 0,5-2µg e pouco sensíveis degradação RIN A260 /A280 = A260 /A230 > 1,8

17 Eletroforese capilar Agilent 2100 bioanalyzer
BMC Molecular Biology 2006, 7:3 doi: /

18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Agilent 2100 bioanalyzer 200pg
200pg Figure 1 A total RNA sample was degraded for varying times and the resulting samples were analyzed on the Agilent 2100 bioanalyzer using the Eukaryote Total RNA Nano assay. A shift towards shorter fragment sizes can be observed with progressing degradation Publication Nº EN, 2004

19 Eletroforese capilar Agilent 2100 bioanalyzer Ratio: 2,0 Ratio: 1,0
DNA contamination

20 RNA Integrity Number (RIN)
Considera o Resultado do eletroferograma completo e não só a relação 28S:18S Electropherogram detailing the regions that are indicative of RNA quality Publication Nº EN, 2004

21 RNA Integrity Number (RIN)
Picos anômalos Críticos ou não Aumentar Threshold Publication Nº EN, 2004

22 RNA Integrity Number (RIN)
Publication Nº EN, 2004

23 RNA Integrity Number (RIN)
Amostras idênticas Evita a interpretação dependente do usuário, interlab. Publication Nº EN, 2004

24 RNA Integrity Number (RIN)

25 Aplicações com RNA Expressão Gênica Transcriptoma Estratégias
Northern Blot Macroarray Microarray Subtração ESTs RT-PCR semi- quantitative RT-qPCR cDNA-AFLP SAGE etc.

26 RT: Reverse Transcriptase
mRNA 1 < 1 ng 2 Enzima Transcritase Reversa dNTPs Primer Cl2Mg Inibidor de ribonuclease, 3 anelamento: 25 ºC-5 min extensão : 42ºC – 60 min inativação: 70ºC – 15 min RNAse H TTTTTTTT 4 A cDNA 5 PCR

27 MT I 5’UTR MT I 3’UTR MT II 5’UTR M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 M
CA287650 MT I 5’UTR MT I 3’UTR MT II 5’UTR M M MT I 5’– 3’UTR GAPDH MT III 5’UTR M M B 123 246 984 pb

28 RT-PCR: Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction
Amidohydrolase gene (sILR1) Arabidopsis suecica (ILR1) Arabidopsis thaliana SEMI QUANTITATIVA

29 Northern blot 5-10µg

30 Otimização no Carregamento do Gel
1 2 3

31 Gel não desnaturante

32 Transportador de Fosfato
Northern blot Transportador de Fosfato Doses de Pi (m M) SCEQRT1028B07.g Doses de Pi (mM) SCEPRZ3089D05.g A B 28S 18S 5S Cana-de-açúcar rRNA

33 Northern blot: Metalotioneína II
MT II /5.8 S 11 days 33 days MT II 5.8 S Cd (mM) Sereno et al., 2007

34 Obrigada pela Atenção


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