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EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE RNA Ma. Lorena Sereno Antonio Figueira 2008.

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1 EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE RNA Ma. Lorena Sereno Antonio Figueira 2008

2 INTRODUÇÃO RNA = ácido ribonucléico: Polímero de Ribonucleosídeos fosfatados Açúcar = Ribose Bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina, Uracila Timina, Pseudouridina, Citosina/Guanina metiladas Tipos variáveis Funções celulares diversas Tipos variáveis Funções celulares diversas

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4 TIPOS / FUNÇÕES do RNA Populares RNA mensageiro (mRNA) = cópia temporária de genes para síntese de proteínas RNA de transferência (tRNA) = adaptador para decodificação do código genético RNA ribossômico (rRNA) = catálise da síntese de proteínas Atividade transcricional do genoma humano

5 Funções = regulação e catálise de ácidos nucléicos (auto-processamento) Hipótese do início da vida (RNA world) Único polímero biológico capaz de realizar catálise (~proteína) e armazenar informação (~DNA) Hipótese do início da vida (RNA world) Único polímero biológico capaz de realizar catálise (~proteína) e armazenar informação (~DNA) Genomic loci mRNA, transp, virus, heterocromatin

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8 ESTRUTURA dos RNAs Difração de Raios X Ressonância Magnética Nuclear Modelagem Teórica Computacional (base experimental) SEQUENCIAMENTO Probabilidade de dobramento Pareamento de bases Viabilidade energética ESTRUTURA - FUNÇÃO

9 Estrutura dos RNAs Exemplos (3D): mRNA viral associado a proteína mRNA viral indutor de tumor

10 Estrutura dos RNAs Exemplos: tRNA – Phe de levedura rRNA 5S

11 Estrutura dos RNAs Exemplos: RNA dupla hélice snRNA Okazaki

12 Extração de RNA: Teoria da Prática Células Procarióticas/Eucarióticas complexidade química integridade das moléculas de RNA (instável ex vivo) Objetivos separar os ácidos nucléicos dos demais componentes celulares separar RNA do DNA contaminante (pureza) manter a integridade molecular do RNA (informação) Tecidos Vegetais polissacarídeos compostos fenólicos e oxidativos nucleases (RNAses) todos os organismos!

13 Extração de RNA - Métodos Lise Celular Separação dos Componentes Celulares Precipitação de RNA Lavagem de RNA Ressuspensão SDS, CTAB, Trizol, Tris, EDTA, PVP, Mercaptoetanol, Guanidina-tiocianato TRIZOL, Fenol, Guanidina tiocianato, Clorofórmio, Álcool Isoamílico Isopropanol, Etanol, LiCl Etanol 75% ddH 2 O-DEPC DEPC

14 Preparo de material livre de RNAse Luvas de látex descartáveis Materiais plásticos descartáveis (tubos e ponteiras) Pipetadores automáticos exclusivos Cadinhos e pistilos : solução de 0,01 % SDS (p/v), água destilada, água ultrapura (milliQ) incubados com água 0,01% de dietilpirocarbonato (DEPC) ativo (2h) autoclavados (120 C) /20 min - estufa (80 C) Soluções de trabalho: preparadas com água 0,01% DEPC autoclavada. Cubas de eletroforese e pentes: lavar com 0,01% SDS e enxaguar água livre de RNAse (água DEPC) Vidraria idem - autoclave Alternativa/: 150ºC por 4 h ou Peróxido de hidrogênio 3%-15 min ou 10 min. 0,5 M NaOH

15 Extração de RNA - Análise Integridade Eletroforese em gel de agarose 1,0-1,4 % (2-3 V/cm) Gel desnaturante (pre trat RNA) / não- desnaturante Bandas de rRNA visíveis e com intensidade proporcional (brometo de etídeo ou SYBR green) smear de mRNA (?) 28S 18S 5S

16 Rendimento e Pureza (métodos) massa de RNA / massa da amostra Quantificação: leitura da absorbância a 260 nm (espectrofotômetro) 1,0 unidade A 260 ssRNA = 40 g/ml A 260 /A 280 ~ 1,8 (sem contaminação por proteínas e fenóis) A 280 = proteínas; A260 =DNA A 230 = polissacarídeos; contaminantes orgánicos A 320 = background (impurezas)... Prática! Bandas ribossômicas: 28S:18S = 2,0 0,5-2µg e pouco sensíveis degradação RIN A 260 /A 280 = A 260 /A 230 > 1,8

17 BMC Molecular Biology 2006, 7:3 doi: / Eletroforese capilar Agilent 2100 bioanalyzer

18 Publication Nº EN, 2004 Agilent 2100 bioanalyzer 200pg

19 Ratio: 2,0 Ratio: 1,0 Eletroforese capilar Agilent 2100 bioanalyzer Ratio: 1,5 DNA contamination

20 Publication Nº EN, 2004 RNA Integrity Number (RIN) Considera o Resultado do eletroferograma completo e não só a relação 28S:18S

21 Publication Nº EN, 2004 RNA Integrity Number (RIN) Picos anômalos Críticos ou não Aumentar Threshold

22 Publication Nº EN, 2004 RNA Integrity Number (RIN)

23 Publication Nº EN, 2004 RNA Integrity Number (RIN) Amostras idênticas

24 RNA Integrity Number (RIN)

25 Aplicações com RNA Expressão Gênica Transcriptoma Estratégias Northern Blot Macroarray Microarray Subtração ESTs RT-PCR semi- quantitative RT-qPCR cDNA-AFLP SAGE etc.

26 RT: Reverse Transcriptase 3 5 PCR RNAse H TTTTTTTT 4 A A A cDNA 2 Enzima Transcritase Reversa dNTPs Primer Cl 2 Mg Inibidor de ribonuclease, anelamento: 25 ºC-5 min extensão : 42ºC – 60 min inativação: 70ºC – 15 min mRNA 1 < 1 ng

27 MT I 5UTRMT I 3UTR MT II 5UTR M M MT I 5– 3UTRGAPDH MT III 5UTR M M B pb pb CA287650

28 RT-PCR: Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction Amidohydrolase gene (sILR1) Arabidopsis suecica (ILR1) Arabidopsis thaliana SEMI QUANTITATIVA

29 Northern blot 5-10µg

30 1 2 3 Otimização no Carregamento do Gel

31 Gel não desnaturante

32 Doses de Pi ( M) SCEQRT1028B07.g Doses de Pi ( M) SCEPRZ3089D05.g A B A B Cana-de-açúcar rRNA Northern blot Transportador de Fosfato 28S 18S 5S

33 Northern blot: Metalotioneína II MT II /5.8 S 11 days 33 days MT II 5.8 S Cd ( M) Sereno et al., 2007

34 Obrigada pela Atenção


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