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Revisão Ácidos Nucleicos Antonio Figueira CENA. Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos Papel de nucleotídeos no metabolismo celular: –constituinte dos ácidos.

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1 Revisão Ácidos Nucleicos Antonio Figueira CENA

2 Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos Papel de nucleotídeos no metabolismo celular: –constituinte dos ácidos nucleicos - RNA e DNA –fonte de energia no metabolismo -> ATP –molécula-sinal em respostas celulares - > cAMP –componente estrutural de enzimas e co- fatores -> NAD, FAD, etc

3 Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos DNA: Armazenamento da informacão genética –estabilidade RNA: várias funções –RNA ribossomal (rRNA) - componentes estruturais de ribossomos –RNA mensageiro (mRNA) - intermediário –RNA transferência (tRNA) - moléculas adaptadoras que traduzem informação do mRNA em amino ácidos –snRNA, microRNA, etc

4 Dogma Central

5 Ácidos Nucleicos RNA e DNA Unidades: Pentose (5 C) Base nitrogenada – pirimidinas purinas Fosfato - C - 5

6 Nucleotídeos Base nitrogenada + Pentose + Fosfato Nucleosídeo = Base nitrogenada + Pentose

7 Pentoses Ribose em RNA 2-deoxi-ribose em DNA -furanose

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10 Nucleotídeos Base nitrogenadas Pirimidina: Timina, Uracil e Citosina Purina: Adenina e Guanina

11 Ácidos Nucleicos Numeração: Pentose = Carbonos – 1 a 5 Base nitrogenada – pirimidinas = 1 a 6 purinas = 1 a 9 Ligação pentose – pirimidina – C 1 N-1 pentose – purina – C 1- N-9 Fosfato 5: mono-, di-, tri- = fósforo ligação éster (baixa energia) ligação fosfoanidro (alta energia)

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13 Nucleotídeos Base Nucleosídeo Nucleotídeo AdeninaAdenosinaAdenilatoRNA DeoxiadenosinaDeoxiadenilatoDNA GuaninaGuanosinaGuanilatoRNA DeoxiguanosinaDeoxiguanilatoDNA CitosinaCitidinaCitidilatoRNA DeoxicitidinaDeoxicitidilatoDNA TiminaTimidinaTimidilatoDNA UracilUridinaUridilatoRNA

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16 Bases modificadas

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18 Ligação Fosfodiester Polaridade 5 -> 3 pH 7 = fosfatos c/ carga negativa neutralizados por interações iônicas com ptn, ions, poliaminas

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21 Estrutura do DNA 2 cadeias independentes Dupla hélice, sentido direito Hélices anti-paralelas Complementariedade das bases Eixo externo hidrofílico - deoxiribose + fosfato Bases hidrofóbicas (planas) no interior Bases ligadas pontes de H + empilhadas (stacking) Major groove e Minor groove (ondulação)

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24 Estrutura do DNA Bases hidrofóbicas, relativamente insolúveis em água pH neutro > solublidade em pH + ácido ou + básico interações hidrofóbicas por empilhamento (base stacking) - duas bases planas sobrepostas stacking função de força van der Waals e interação dipolo-dipolo entre bases minimiza contato com água

25 Estrutura do DNA Estabilidade da estrutura secundária: 1.Pontes de H – pareamento Watson e Crick função de forma tautômero – distância correta entre C-1 -> A -T e G - C 2.Interações hidrofóbicas 1.Empilhamento (base stacking) = interação de nuvens de elétrons 2.Hidrofobicidade (cavitation energy) = quebra de pontes de H da água – força bases internamente

26 Estrutura do DNA Pareamento de bases crítico: 1.Biológico – replicação, transcrição, controle expressão gênica 2.Análise – Hibridização, PCR, microarranjo, seqüenciamento

27 Propriedades de Nucleotídeos moléculas altamente conjugadas afetando estrutura, distribuição de elétrons e absorção de luz UV moléculas planas (pirimidina) ou quase (purina) absorbância máxima - cerca 260 nm

28 Espectro de absorbância de nucleotídeos

29 Química de Ácidos Nucleicos Estabilidade do DNA - depósito genético! Propriedades Desnaturação = separação da dupla fita –quebra das pontes de H –causado por calor ou pH (e proteínas in vivo) Renaturação ou anelamento –decréscimo da temperatura ou pH Alteração na Absorbância (UV) Abs 260 nm –hipocromicidade: renaturação –hipercromicidade: desnaturação

30 Desnaturação e renaturação do DNA Desnaturação Calor – melting pH extremos – DNA em pH 12 –Ácido - hidrolisa DNA e RNA –Base – hidrolisa RNA Processo de desnaturação altera Absorbância –Perda de stacking – aumenta Abs 260 nm –DNA fita simples – hidroxiapatita e S1 nuclease –Alteração Hipercrômica – aprox. 30% maior

31 Cinética de Renaturação 1. Solução de DNA aquecida lentamente 2. Medir Abs 260nm 3. Gráfico Abs x Temperatura 4. DNA desnatura em faixa estreita de T o C de forma cooperativa = T m T m = temp. 50% DNA desnaturado T m = função de [sais] Conceito usado em sondas e primers (estringência) DNARNA

32 Cinética de Renaturação Renaturação não apenas reverso de desnaturação! ocorre naturalmente 5 – 10 o C abaixo Tm -Renaturação = função de [DNA] – freqüência de bases complementares se encontrarem -Depende de complexidade do genoma -Genoma – não retorna a Abs 260nm original -Genoma fragmentado – renatura completamente -Renaturação = função tamanho e complexidade do genoma -Afetado concentração de sais e temperatura

33 Taxa de Renaturação - Função do tamanho do genoma - Genoma menor renatura mais rapidamente Curvas CoT C/C o = 1/(1 + kC o T) C = [ssDNA] Co = [DNA] K = constante da taxa de reassociação T = tempo

34 Cinética de Renaturação Temperatura de desnaturação = Tm –Função: composição G+C Permite estimar tamanho de genoma (C o T) 1/2 Complexidade do Genoma –soma dos comprimentos das seqüências únicas mais as unidades de comprimento de cada família de seqüências repetitivas –Seqüências únicas – componente cinético único –> componente cinéticos genoma complexo

35 Fold-back Highly Repetitive Medium Repetitive Single/Low copy Curva Cot Cebola

36 Cinética de Renaturação Complexidade de Seqüência: grupo mínimo (em pb) que define o genoma; Valor Cot: definido como o produto da concentração de nucleotídeos em moles por Litro (Co) e seu tempo de renaturação (t); Componente Cinético: grupo de seqüências genômicas que exibem propriedades de renaturação similares, e consequentemente aparecem como região sigmoidal distinta na curva Cot.

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38 Número de clones necessários para 99% certeza que todas as seqüências estão presentes Z = tamanho médio inserto (pb) G = tamanho 1 C do genoma (pb) Número de clones necessários para 99% certeza que todas as seqüências estão presentes considerando as frações de componentes cinéticos (a, b, c e f)

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40 Artigos publicados sobre cinética de reassociação

41 RNA Jacob & Monod -> RNA intermediário –RNAs ocorrem no núcleo e citoplasma mRNA –monocistrônico - eucariotos –policistrônico - procariotos rRNA tRNA

42 rRNA em Ribossomo tRNA

43 Hidrólise espontânea de RNA em condições alcalinas

44 Estrutura de RNA mRNA -> fita simples –tendem a assumir conformação helicoidal direita dominada pelo emplihamento das bases (pur-pur) –auto-complementariedade - estrutura mais complexas –pareamento: A-U, G-C e G-U! –estrutura 3 ária função de seqüência (~ a ptn) interações com grupo OH de C-2 formas A e Z, mas não ocorre forma B! rRNA tRNA

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48 Química de Ácidos Nucleicos Transformações não -enzimáticas desaminação - perda de grupo amina –alterações espontâneas, baixíssima taxa –perda de amina por C -> U - reconhecido em DNA taxa h -1 –DNA - possui T ao invés de U!

49 Química de Ácidos Nucleicos Transformações não -enzimáticas hidrólise da ligação N- -glicosidil entre base e pentose ou Depurinação –ocorre mais para purinas –acelerado em meio ácido

50 Química de Ácidos Nucleicos Transformações não - enzimáticas radiação UV –condensação de 2 etilenos em ciclobutano –DNA - 2 pirimidinas (T) adjacentes -> dímeros agentes ambientais –deaminanntes –alquilantes

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