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RODRIGO ROCHA LATADO. Tópicos IntroduçãoIntrodução Principais característicasPrincipais características Sistemas de cultivo in vitro de células e tecidosSistemas.

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1 RODRIGO ROCHA LATADO

2 Tópicos IntroduçãoIntrodução Principais característicasPrincipais características Sistemas de cultivo in vitro de células e tecidosSistemas de cultivo in vitro de células e tecidos Aplicações das técnicas de cultura de tecidos vegetaisAplicações das técnicas de cultura de tecidos vegetais

3 BIOTECNOLOGIA VEGETAL:Cultura de Tecidos Manipulação Genética Biologia Molecular Cultura de tecidos vegetais - Nome genérico que se dá aos vários procedimentos de cultivo in vitro de células, tecidos e órgãos vegetais em um meio nutritivo e em condições assépticas. Extraído de Glossário de Biotecnologia (2005) INTRODUÇÃO

4 Principais Características in vitro = cultivo em frascos de vidro ou de plástico; ambiente artificial (físico e nutricional); ocupa menor espaço físico; diferentes tipos de células, tecidos e órgãos; ambiente asséptico = ausência de microorganismos e insetos;

5 Cultivo in vitro de banana (micropropagação)

6 Cultivo in vitro de banana aclimatizaçãoPlantio

7 Cultura in vitro de banana Fotos: Tulmann Neto

8 Cultivo in vitro de banana Foto: P.H. Viégas

9 HISTÓRICO TOTIPOTÊNCIA - 1 o dos primeiros fundamentos da cultura de tecidos vegetais "...cell is capable of autonomy and even that is totipotent..." (Schleiden, 1838; Schwann, 1839)...célula é autônoma, portanto, contém o potencial necessário para originar uma planta... Entretanto, a totipotência somente é expressa sob condições especiais de estímulos.

10 HISTÓRICO Gottliet Haberlandt ( ) CULTURA DE TECIDOS Fisiólogo vegetal austro-húngaro (G. Haberlandt, 1902) foi o 1o a tentar cultivar plantas in vitro, entretanto, devido a limitações técnicas da época, não obteve sucesso. "Haberlandts vision was of achieving continued cell division in explanted tissues on nutrient media – that is, of establishing true, potentially perpetual, tissue cultures." "Harbelandt originated the conceptual and was the first to attempt to cultivate isolated plant cells "in vitro" on an artificial medium." (Dodds & Roberts, 1995)

11 HISTÓRICO 1900: Idéias sobre totipotência (Morgan, 1901) (Haberlandt, 1902) primeiro a tentar o cultivo de células vegetais (folha); : Trabalhos básicos sobre assepsia, formulação de meios nutritivos, descoberta de auxinas; Indução e cultivo de calos;

12 HISTÓRICO primeiro trabalho de cultura de tecidos - ápices radiculares de tomate por tempo indefinido (White); identificação da auxina AIA (Kogh et al.); importância da tiamina (vitamina) para o crescimento de raízes in vitro e elaborou uma mistura orgânica, utilizada até hoje (White); obtenção e manutenção por tempo indefinido de calo de cenoura (Gautheret; Nobércour); White: obtenção de calo de fumo;

13 HISTÓRICO 1940 – 1970: Formulação de meios nutritivos, cultura de ápices meristemáticos, células em suspensão, embriogênese somática, isolamento de protoplastos e regeneração de plantas; 1970 – 1990: Primeiros trabalhos sobre manipulação genética, fusão de protoplastos e plantas transgênicas;

14 HISTÓRICO adição de água de coco aos meios de cultura (Van Overbeek et al.); a regeneração de plantas a partir de ápices meristemáticos de Lupinus (Ball); uso prático - obtenção de plantas de dália, livres de vírus (Morel & Martin); 1960 – mesmo para orquídeas (Morel);

15 HISTÓRICO 1955 e (Miller et al.) - descoberta da cinetina - regeneração de parte aérea/raiz de tabaco depende do balanço auxina/citocinina 1958 – (Steward et al.) e (Reinert) - formação de embriões somáticos de cenoura isolamento de protoplastos tomate (Cocking) 1962 – formulação do meio de cultura MS (Murashige & Skoog);

16 HISTÓRICO 1966 – plantas haplóides a partir de cultura de anteras de Datura (Guha & Maheshwari); 1971 – regeneração de plantas a partir de protoplastos (Takebe et al.); fusão de protoplastos de Nicotiana glauca e N. langsdorfii (Carlson et al.); 1978 – obtenção de híbridos somáticos entre tomate e batata (Melchers et al.);

17 HISTÓRICO 1974 – descobriram que o plasmídeo-Ti era o princípio indutor da A. tumefaciens, possibilitando a transformação de plantas (Zaenen et al.; Van Larebeke et al.); 1977 – integração de DNA plasmidial, em células de tabaco (transformação genética) (Chilton et al.); 1979 – desenvolveram a técnica de co-cultivo (Marton et al.); obtiveram plantas transformadas de tabaco (Horsch et al.);

18 HISTÓRICO 1994 – Lançamento comercial da 1 a planta transgênica; Tamate Flavr Savr (Calgene)

19 HISTÓRICO 1990 – hoje: desenvolvimento de protocolos mais eficientes de cultura de tecidos; Universidades e Centros de Pesquisa - estudos básicos: fisiologia e bioquímica - desenvolvimento de protocolos: Organogênese e Embriogênese somática Cultura de células haplóides, protoplastos, etc… Seleção in vitro Produção de sementes sintéticas Transformação genética

20 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS EXPLANTE- qualquer segmento de tecido oriundo de uma planta para iniciar uma cultura in vitro, geralmente com vistas a estabelecer um protocolo de plantas de genótipo superior. meristemas pré-existentes - exemplos: ápice caulinar, meristema, segmento nodal e sementes não meristemáticos - exemplos: disco de folha, segmentos de raiz, segmentos de folha

21 EXPLANTES ápices caulinares Estruturas Arroz

22 EXPLANTES Meristema

23 EXPLANTES Segmento Nodal

24 EXPLANTES Discos de folha Segmentos de raiz

25 SISTEMAS DE CULTURA IN VITRO DE CÉLULAS E TECIDOS Cultura de Embrião: Embrião zigótico imaturo ou maduro; Cultura de Órgãos: meristema, raiz, gemas, outros. Cultura de Calos: cultivo de uma massa não-diferenciada de células. Cultura de Células em Suspensão: cultura de células isoladas e/ou em pequenos agregados, incubada sob agitação. Embriogênese Somática: produção de embrião morfologicamente semelhante a um embrião zigótico que é diferenciado a partir de células somáticas. Cultura de Células Haplóides: cultura de anteras, grãos de pólen e óvulos, com o objetivo de se obter plantas haplóides. Cultura de Protoplastos: isolamento e cultivo de células sem parede celular.

26 Cultura de embriões Mamão Fonte: Cid (2003)

27 Cultura de órgãos (gema axilar) Micropropagação de Café Fonte: Cid (2003)

28 Cultura de órgãos (gema caulinar) Abacaxi Fonte: Cid (2003)

29 Cultura de órgãos (segmento epicótilo) Citros Fonte: Almeida (2002)

30 Cultura de calos Eucalipto Fonte: Cid (2003)

31 Cultura de células em suspensão Café Fonte: Koehler (2006) Fonte de explantes

32 Cultura de células em suspensão Citros

33 Cultura de embriões somáticos Café Fonte: Cid (2003)

34 Cultura de protoplastos Banana Fonte: Assani et al. (2006)

35 APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS Pesquisa Básica: fisiologia e bioquímica vegetal Micropropagação: mudas de alta qualidade e em grande quantidade Limpeza de Vírus: vírus sistêmicos em espécies de propagação vegetativa Cultivo de Embrião: dormência de sementes ou embriões obtidos de cruzamentos entre parentais distantes Embriogênese Somática: produção de sementes sintéticas Plantas Haplóides ou duplo-haplóides: obtenção de linhagens homozigotas Conservação de Germoplasma in vitro Manipulação Genética: hibridação somática, transformação genética, seleção in vitro, indução de mutações

36 Pesquisa Básica: fisiologia e bioquímica vegetal Como é possível se obter: - linhagens celulares homogêneas, sem clorofila e com ciclo sincronizado; - células isoladas (protoplastos); - grande número de células e plantas num pequeno espaço e sob condições artificiais; APLICAÇÕES bioquímica:- nutrição celular e de plantas; - cadeia de transporte em membranas; - toxidez e detoxificação celular; - metabólitos secundários; fisiologia:- ciclo celular; - fatores de crescimento; - senescência; - vias de regeneração (embriogênese somática); - fatores que afetam a fotossíntese;

37 Micropropagação clonal - Produção de mudas em larga escala (plantas idênticas); - Maior utilização comercial da cultura de tecidos; - Necessidade de se ajustar os protocolos para cada espécie, variedade ou clone; Espécies que mais têm sido utilizadas para a microprapagação comercial (cana-de-açúcar, Pinus, eucalipto, banana, abacaxi, morango, batata e ornamentais). Cuidados para se evitar a variação somaclonal !!!!! Variação Somaclonal: variação detectada em plantas regeneradas por cultura de tecidos (Larkin & Scowcroft, 1981);

38 Micropropagação de baunilha Micropropagação de mandioca Fonte: Santos (2001)

39 Limpeza de vírus Principais culturas: Cana-de-açúcar, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais

40 Limpeza de vírus termoterapia + cultura do ápice meristemático ex: vírus do mosaico da cana-de açúcar cultura de meristema: explante 0,3 mm cultura ápice meristemático (1 – 2,5 cm) + termoterapia (45 o C / 8 horas) quimioterapia + cultura do ápice meristemático incorporação de antivirais no meio de cultura Indexação: avaliação da presença do vírus ensaios biológicos microscopia eletrônica serologia (ELISA) hibridação com ácidos nucléicos

41 Cultivo de embrião Cultivo de embriões zigóticos imaturos ou maduros Objetivos: -Superar a dormência de sementes (devido a imaturidade ou pela presença de inibidores no endosperma); - Recuperar híbridos raros de cruzamentos incompatíveis;

42 Embriogênese somática Cultivo de embriões somáticos - Constitui-se numa importante ferramenta para os estudos básicos relacionados com a fisiologia e gênese do desenvolvimento do embrião; - Método para propagação de plantas elite com uso de biorreatores e produção de sementes sintéticas; - Produção de plantas transgênicas;

43 Embriogênese somática e sementes sintéticas O conjunto de técnicas que visa o emprego de embriões somáticos é chamado de tecnologia de sementes sintéticas ou artificiais.

44

45 Cultura de células haplóides ou duplo-haplóides Cultivo de células haplóides (grãos de pólen, anteras e óvulos); Objetivos - Obtenção de plantas haplóides; - Obtenção de plantas duplo-haplóides (plantas completamente homozigotas) em apenas um ciclo e sem a necessidade de realizar cruzamentos; -Vantagem: tempo

46 Cultura de anteras e pólen Anteras Micrósporo germinando Embriogênese somática Embriões somáticos Gramínea

47 Cultura de óvulos Flor - OvárioÓvulos Calos Organogênese somática Obtenção de plantas Multiplicação Tabaco

48 Conservação do germoplasma in vitro - Conservação do germoplasma em pequeno espaço, a baixo custo e mantendo a integridade genética do acesso; - Maior interesse para espécies de propagação vegetativa, tais como: alho, mandioca, batata, batata doce e outras; - Evitar a variação somaclonal !!! - Possibilidade de troca de germoplasma sadio (sem risco de novas doenças e pragas);

49 Manipulação Genética - Ampliação da variabilidade: indução de variação somaclonal; -Obtenção de novos materiais: hibridação somática, hibridação assimétrica, cibridização; - Servir como apoio para outras técnicas: Indução de mutações, poliploidização com uso de colchicina, transformação genética e outras; - Seleção in vitro de linhagens celulares e plantas;

50 Bibliografia consultada: Borém, A.; Veira, M.L.C. Glossário de Biotecnologia, Viçosa, Editora Folha de Viçosa, Roca, W.M. Mroginski, L.A.; Cultivo de tejidos em la agricultura fundamentos y aplicaciones. Colômbia, CIAT, 1991, 970p. Torres A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília, EMBRAPA-SPI v.1, 1998, 864p. Torres A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília, EMBRAPA-SPI v.2, 1999, 354p. Revista BIOTECNOLOGIA Ciência e Desenvolvimento. KL3 Publicações: Brasília, 2001.


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