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Obtenção de Cultivares Transgênicas
Grupo 4: Filipi Rodrigues Nathalia Brancalleão Renata Rebellato Linhares Tarcísio Vasconcelos
2
Início Seleção de sementes das melhores plantas e de seus cruzamentos espontâneos primeira planta transgênica com gene codificante para a resistência contra o antibiótico canamicina introduzido em plantas de fumo
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Transformação genética
Inserção direta de um gene de interesse Genes da própria espécie, de outras espécies ou sintéticos
4
Métodos de transformação
Agrobacterium tumefaciens Bombardeamento
5
Ferramentas essenciais
Conhecimento da Cultura Bioinformática Clonagem Microbiologia Definição do método de transformação Cultura de tecidos vegetais Biologia molecular
6
Bioinformática Definição do gene de interesse
Estudo dos sítios de restrição Desenho de primers
7
Clonagem – Agrobacterium tumefaciens
Inserção do gene em vetores de expressão Adição de promotores Inserção dos vetores
8
Gene Escolhido – npr1 isoforma 7
9
PCR
10
Clonagem inicial – vetor de clonagem
Fácil inserção do gene Genes de seleção
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Produto inicial
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Inserção do vetor na bactéria – E. coli
Crescimento bacteriano Seleção de colônias transformadas Replicação do DNA Avaliação da inserção por digestão enzimática
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Avaliação enzimática 1
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Inserção no vetor intermediário
15
Inserção do vetor na bactéria – E. coli
Crescimento bacteriano Seleção de colônias transformadas Replicação do DNA Avaliação da inserção por digestão enzimática
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Avaliação enzimática 2
17
Inserção no vetor final
18
Inserção do vetor na bactéria – E. coli
Crescimento bacteriano Seleção de colônias transformadas Replicação do DNA Avaliação da inserção por digestão enzimática
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Avaliação enzimática 3
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Inserção do vetor final em A. tumefaciens
Via eletroporação Choque térmico Sequenciamento
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Transformação genética
Escolha de explantes Protocolo de regeneração Uso de reguladores vegetais para regeneração de plantas Regenerar a célula transformada em uma planta completa transformada
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Via A. tumefaciens Contato entre explante e A. tumefaciens transformada.
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Co-cultivo Cultura conjunta por poucos dias de planta e bactéria, sem antibióticos – disco foliares
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Bombardeamento Partículas de ouro ou tungstênio recobertas pelo vetor de transformação Vetor de aproximadamente 15Kb Bombardeador de alta pressão de gás Helio
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Seleção Cultivo em meio com antibiótico Canamicina Cefotaxima
Seleção de brotações adventícias transformadas Cefotaxima Eliminação de A. tumefaciens
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Regeneração
27
Regeneração
28
Regeneração
29
Aclimatização
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Avaliação Expressão transiente PCR Southern Blot Western Blot qPCR
RT-PCR
31
Expressão transiente
32
PCR
33
Obrigado
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