Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus subtilis

Apresentação em tema: "Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus subtilis"— Transcrição da apresentação:

1 Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus subtilis
2010 26 a 30 de Julho Estudo dos supercomplexos da cadeia respiratória de Bacillus subtilis Responsável: Ana Melo Monitores: Pedro Sousa Filipe Santos Participantes: Carolina Camelo Inês Santos Magda Paiva Sara Silva

2 Cadeia respiratória de B. subtilis

3 Amplificação do gene codificante da subunidade A da citocromo c oxidase (qoxA) de B. subtilis.
Colónia Wt (2x) H2O Milipore ΔqoxA (1x) Ferver 5 min. Δ qoxB (1x) Lise celular Desnaturação DNAses 1 min. a RPM WT PCR de Colónias Marcador gap (>100 bp) qoxB (100 bp) DNA H2O estéril Tampão dNTP Primer Fw Primer Rev Taq Polimerase qoxA (100 bp) Gel de agarose

4 Ligação do gene ao vector plasmídico (pSKEcoRV)
qoxA GTGATCCTCTTGTTCAGAGCATTTAAACCACTGATTATGCTGACTCTGCTTTCCTCCGTTTTTTTATTGGGCGGCTGCAGTCAAATCGCGGTATTGGAT Ligação H2O estéril Tampão da ligase pSKEcoRV (desfosforilado) Produto de PCR (qoxA ou qoxB) T4 DNA ligase 22ºC

5 Transformação do produto da ligação nas células de E. coli.
pSK_qoxA Transformação 37ºC Ecoli XL1Blue Incubar overnight Colónias de bactérias com plasmídeo sem produto de ligação Colónias de bactérias com plasmídeo com produto de ligação

6 Espectros de UV/Visível de B. subtilis
Cadeia respiratória de B. subtilis NDH-2 SDH Q caa3 bd aa3 bc1 cytc Grupo prostético Comprimento de onda Hemo a 441 601 Hemo b 429 550 Hemo c 560 Hemo d 631 Podemos concluir que as oxidases terminais caa3 e bd da cadeia respiratória de B. subtilis estão presentes neste crescimento.

7 Actividades enzimáticas
Actividade NADH:oxigénio oxidoredutase Após NADH 28,9 nmol min-1 mg-1 Após KCN 15,7 nmol min-1 mg-1 % (inibição) 45,7 Actividade NADH:K3[Fe(CN)6] oxidorredutase= 110 nmol NADH min-1 mg-1 Actividade succinato:oxigénio oxidoredutase Após succinato 14,32 nmol min-1 mg-1 Após KCN 10,58 nmol min-1 mg-1 % (inibição) 26,12 Actividade succinato:DCPIP oxidorredutase = 151,7 nmol DCPIP min-1 mg-1

8 BN-PAGE Massa Molecular dos complexos isolados NDH-2  45 kDa
caa3  145 kDa aa3  147 kDa bc1  73 kDa SDH  116 kDa bd  218 kDa ou 90 kDa Supercomplexos identificados: (SDH)3 NDH-2:(SDH)3 Banda 7 Bandas 2 e 6 Nota: É necessário confirmar os resultados obtidos por Espectrometria de Massa

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