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IMUNIZAÇÃO ORAL CONTRA A ESQUISTOSSOMOSE COM Salmonella typhimurium ATENUADA CARREANDO PLASMÍDEOS (VACINAS DE DNA) PORTADORES DO GENE Sm14. Luis Gustavo.

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1 IMUNIZAÇÃO ORAL CONTRA A ESQUISTOSSOMOSE COM Salmonella typhimurium ATENUADA CARREANDO PLASMÍDEOS (VACINAS DE DNA) PORTADORES DO GENE Sm14. Luis Gustavo Carvalho Pacheco Orientador: Prof. Dr. Vasco Azevedo Co-Orientador: Prof. Dr. Alan Lane de Melo

2 LABORATÓRIOS Genética Celular e Molecular (LGCM), Dep. de Biologia Geral. Taxonomia e Biologia de Invertebrados, Dep. de Parasitologia. Imunologia das Doenças Infecciosas, Dep. de Bioquímica e Imunologia.

3 PLANO DE APRESENTAÇÃO INTRODUÇÃO OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES AGRADECIMENTOS

4 VACINA DE DNA Histórico e conceito Mecanismos de indução de resposta imunológica. Vias de administração.

5 BACTÉRIAS CARREADORAS Vantagens. Mecanismo de transferência de plasmídeos vacinais. Trabalhos com gene repórter. Outras doenças.

6 Ainda não há trabalhos na literatura relatando o uso de linhagens atenuadas de Salmonella como carreadoras de vacinas de DNA contra doenças parasitárias, incluindo esquistossomose.

7 ESQUISTOSSOMOSE Vermes do gênero Schistosoma Problema sócio-econômico e de saúde pública Pessoas em risco: quase 800 milhões Pessoas infectadas: cerca de 200 milhões No Brasil: ~6,4 milhões (NE e MG) Ciclo biológico (BERGQUIST et al., 2002; KATZ & PEIXOTO, 2000)

8 CICLO DE VIDA DE SCHISTOSOMA spp. Frames/S-Z/Schistos...

9 ESTRATÉGIAS DE CONTROLE Saneamento básico Quimioterapia: oxamniquina e praziquantel Re-infecção em áreas endêmicas VACINA EFETIVA (proteção a longo prazo)

10 CONCEITO DE VACINA PROTETORA Diferente do normalmente associado com vacinas. Imunidade parcial: diminuição da carga parasitária. menos ovos acumulados = redução da reação granulomatosa. menos ovos liberados para o ambiente. (BERGQUIST et al., 2002)

11 CARACTERÍSTICAS IMUNOLÓGICAS Natureza provável da resposta imunológica: dicotômica: células Th1 e Th2 variação na produção de citocinas e imunoglobulinas pelo hospedeiro, de acordo com a fase de desenvolvimento do parasito. (AL-SHERBINY et al., 2003; HOFFMANN & WYNN, 2000)

12 CANDIDATOS VACINAIS 6 antígenos de Schistosoma escolhidos pela OMS como os mais promissores, utilizando proteína recombinante. Sh28GST em fase mais avançada de estudos: BILHVAX (proteína recombinante) diminuição de fecundidade fase II de testes clínicos

13 SM14 FABP (fatty acid-binding protein). Aquisição e utilização de ácidos graxos por diferentes organismos. Vacina bivalente anti-helmíntica. (TENDLER et al., 1996) Vacina de DNA com Sm14. (NASCIMENTO et al., 2002)

14 OBJETIVO GERAL Desenvolver e avaliar a eficácia de uma nova estratégia de imunização contra a esquistossomose experimental.

15 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Transformar a linhagem atenuada SL3261 de Salmonella typhimurium com o plasmídeo vacinal. Digestão e sequenciamento de pCI-Sm14. Ensaios de imunização oral de camundongos SWISS. Avaliar produção de anticorpos. Avaliar proteção conferida aos camundongos contra a esquistossomose experimental.

16 MATERIAIS E MÉTODOS pCMV pCI-Sm14 pCI-neo Amp RESTRIÇÃO ENZIMÁTICA SEQUENCIAMENTO TRANSFORMAÇÃO Salmonella typhimurium SL3261 CURVAS DE CRESCIMENTO ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL

17 7 doses de 10 9 u.f.c foram administradas, no intervalo de 30 dias Meio + Antib. + Bactéria O.N. Diluição1\50 Fase estacionária Fase exponencial 4:30 hs depois O.D. 0,8-0,9... (~10 -8 a UFC/ml) Imunização com 100 µl Meio da fase exponencial Concentração (5 X 10 9 UFC/ml)

18 1 ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORAL 2 INFECÇÃO EXPERIMENTAL RECUPERAÇÃO DOS VERMES 3 ANÁLISES DE PROTEÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS

19 DIGESTÃO E SEQUENCIAMENTO DE pCI-Sm14 Foi confirmada a integridade estrutural do plasmídeo vacinal PM 5000pb 2000pb 1000pb 400pb CANALETAS 8 E 9: Nhe I + Not I

20 CURVAS DE CRESCIMENTO 5,54 x ,36 x ,6 x ,75 x x ,3 x ,9 x 10 8

21 ANÁLISES DE PROTEÇÃO TratamentoNºVermes recuperados (X ± ) % ProteçãoValor p 1º Ensaio de Imunização PBS616,5 ± 3,4__ SL ,3 ± 2,913,30,264 SL3261 (pCI-neo)613,5 ± 2,718,20,122 SL3261 (pCI-Sm14)512,2 ± 1,826,00,032* 2º Ensaio de Imunização PBS720,6 ± 8,3__ SL ,3 ± 10__ SL3261 (pCI-neo)716,7 ± 7,818,90,388 SL3261 (pCI-Sm14)821,5 ± 6,9__

22 Número de fêmeas de S. mansoni recuperadas por camundongo experimental PBS SL3261 pCI-neo pCI-Sm14 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

23 Contagens de ovos maduros e imaturos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos. Estágio dos ovosPBSSL3261SL3261 (pCI-neo)SL3261 (pCI-Sm14) 1º Ensaio Ovos imaturos/nº de fêmeas recuperadas 751,45 ± 512,21698,55 ± 566,76630,75 ± 292,64573,93 ± 448,13 Ovos maduros/nº de fêmeas recuperadas 201,90 ± 101,46441,17 ± 497,26239,20 ± 89,24325,5 ± 139,01 2º Ensaio Ovos imaturos/nº de fêmeas recuperadas 611,83 ± 381,15993,61 ± 811,77969,43 ± 556,60660,77 ± 235,98 Ovos maduros/nº de fêmeas recuperadas 200,64 ± 138,49470,09 ± 571,76398,71 ± 187,59303,97 ± 191,21

24 Contagens totais de ovos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

25 ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORAL PRODUÇÃO DE IgG anti-Sm * 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

26 CONCLUSÕES Não é possível afirmar que a imunização oral com a linhagem vacinal confere proteção a camundongos SWISS, após a infecção experimental com cercárias de S. mansoni. A administração da linhagem de S. typhimurium carreadora de vacina de DNA induz produção de anticorpos IgG anti-Sm14 nos camundongos.

27 AGRADECIMENTOS Pai, mãe e irmãos. Amigos de BH (Pterodactilos Corporation); Amigos de Sete Lagoas; Carol. Professores Vasco Azevedo e Alan de Melo. Colegas do LGCM, do LTBI e do GIDE. Pessoal do LIDI e do Lab. Imunoparasitologia. Pessoal da Biologia e da Genética.

28 Candidatos vacinais contra a esquistossomose AntígenoEstágio expresso Propriedade particular Proteção conferida (%) Cam.RatoOutros (GST 28)Todos estágiosEnzima (primata) (Sm97) Esquistossômulo verme adulto Proteína muscular 30 (IrV-5)Todos estágiosProteína muscular (primata) (MAP-4)Todos estágiosEnzima30-40 Sm23 (MAP-3) Todos estágiosProteína integrada à membrana Sm14 Esquistossômulo verme adulto Antígeno de membrana (coelho)

29 VACINA DE DNA

30 VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

31 MECANISMOS DE TRANSFERÊNCIA DE PLASMÍDEOS VACINAIS POR BACTÉRIAS CARREADORAS WEISS & CHAKRABORTY, 2001.

32 ALGUMAS VACINAS DE DNA CARREADAS POR SALMONELLA LinhagemAntígenoDoençaResposta imunológica S. typhimurium aro - Listeriolisina (Listeria monocytogenes) Infecção instestinal Humoral e celular S. typhimurium aro - Antígeno de superfície do vírus da hepatite B Hepatite BHumoral e celular S. typhimurium aro - Glicoproteína D do vírus da herpes HerpesHumoral e celular S. typhimurium aro - ESAT-6 (Mycobacterium tuberculosis)Tuberculose- S. typhimurium aro - Peptídeo NS3 do vírus da hepatite C Hepatite CCelular S. typhimurium aro - HIV-1 EnvAIDSCelular

33 1798 Varíola 1981 Hepatite B 1992 VACINAS DE 1ª GERAÇÃO 2ª GERAÇÃO VACINAS DE DNA


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