Luis Gustavo Carvalho Pacheco

Apresentação em tema: "Luis Gustavo Carvalho Pacheco"— Transcrição da apresentação:

1 Luis Gustavo Carvalho Pacheco
IMUNIZAÇÃO ORAL CONTRA A ESQUISTOSSOMOSE COM Salmonella typhimurium ATENUADA CARREANDO PLASMÍDEOS (VACINAS DE DNA) PORTADORES DO GENE Sm14. Luis Gustavo Carvalho Pacheco Orientador: Prof. Dr. Vasco Azevedo Co-Orientador: Prof. Dr. Alan Lane de Melo

2 LABORATÓRIOS Genética Celular e Molecular (LGCM), Dep. de Biologia Geral. Taxonomia e Biologia de Invertebrados, Dep. de Parasitologia. Imunologia das Doenças Infecciosas, Dep. de Bioquímica e Imunologia.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
PLANO DE APRESENTAÇÃO INTRODUÇÃO OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES AGRADECIMENTOS

4 VACINA DE DNA Histórico e conceito Mecanismos de indução de resposta imunológica. Vias de administração.

5 BACTÉRIAS CARREADORAS
Vantagens. Mecanismo de transferência de plasmídeos vacinais. Trabalhos com gene repórter. Outras doenças.

6 Ainda não há trabalhos na literatura relatando o uso de linhagens atenuadas de Salmonella como carreadoras de vacinas de DNA contra doenças parasitárias, incluindo esquistossomose.

7 Vermes do gênero Schistosoma
ESQUISTOSSOMOSE Vermes do gênero Schistosoma Problema sócio-econômico e de saúde pública Pessoas em risco: quase 800 milhões Pessoas infectadas: cerca de 200 milhões No Brasil: ~6,4 milhões (NE e MG) Ciclo biológico (BERGQUIST et al., 2002; KATZ & PEIXOTO, 2000)

8 CICLO DE VIDA DE SCHISTOSOMA spp.
Frames/S-Z/Schistos...

9 ESTRATÉGIAS DE CONTROLE
Saneamento básico Quimioterapia: oxamniquina e praziquantel Re-infecção em áreas endêmicas VACINA EFETIVA (proteção a longo prazo)

10 CONCEITO DE VACINA PROTETORA
Diferente do normalmente associado com vacinas. Imunidade parcial: diminuição da carga parasitária. menos ovos acumulados = redução da reação granulomatosa. menos ovos liberados para o ambiente. (BERGQUIST et al., 2002)

11 CARACTERÍSTICAS IMUNOLÓGICAS
Natureza provável da resposta imunológica: dicotômica: células Th1 e Th2 variação na produção de citocinas e imunoglobulinas pelo hospedeiro, de acordo com a fase de desenvolvimento do parasito. (AL-SHERBINY et al., 2003; HOFFMANN & WYNN, 2000)

12 CANDIDATOS VACINAIS 6 antígenos de Schistosoma escolhidos pela OMS como os mais promissores, utilizando proteína recombinante. Sh28GST em fase mais avançada de estudos: BILHVAX (proteína recombinante) diminuição de fecundidade fase II de testes clínicos

13 SM14 FABP (fatty acid-binding protein).
Aquisição e utilização de ácidos graxos por diferentes organismos. Vacina bivalente anti-helmíntica. (TENDLER et al., 1996) Vacina de DNA com Sm14. (NASCIMENTO et al., 2002)

14 OBJETIVO GERAL Desenvolver e avaliar a eficácia de uma nova estratégia de imunização contra a esquistossomose experimental.

15 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Transformar a linhagem atenuada SL3261 de Salmonella typhimurium com o plasmídeo vacinal. Digestão e sequenciamento de pCI-Sm14. Ensaios de imunização oral de camundongos SWISS. Avaliar produção de anticorpos. Avaliar proteção conferida aos camundongos contra a esquistossomose experimental.

16 MATERIAIS E MÉTODOS Salmonella typhimurium SL3261 TRANSFORMAÇÃO
pCMV pCI-neo Amp TRANSFORMAÇÃO pCMV pCI-Sm14 Amp CURVAS DE CRESCIMENTO SEQUENCIAMENTO RESTRIÇÃO ENZIMÁTICA ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL

17 ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL
7 doses de 109 u.f.c foram administradas, no intervalo de 30 dias. 10-1 10-2 10-7 Meio + Antib. + Bactéria O.N. Diluição1\50 Fase estacionária Fase exponencial 4:30 hs depois O.D. 0,8-0,9 ... (~10-8 a 10-9 UFC/ml) Imunização com 100 µl Meio da fase exponencial Concentração (5 X 109 UFC/ml)

18 MATERIAIS E MÉTODOS ANÁLISES DE PROTEÇÃO 1 ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORAL 2 INFECÇÃO EXPERIMENTAL RECUPERAÇÃO DOS VERMES

19 DIGESTÃO E SEQUENCIAMENTO DE pCI-Sm14
Foi confirmada a integridade estrutural do plasmídeo vacinal. PM 5000pb 2000pb 1000pb 400pb CANALETAS 8 E 9: Nhe I + Not I

20 CURVAS DE CRESCIMENTO 2,36 x 109 4,75 x 105 5,54 x 108 1,6 x 105

21 Vermes recuperados (X ± )
ANÁLISES DE PROTEÇÃO Tratamento Nº Vermes recuperados (X ± ) % Proteção Valor p 1º Ensaio de Imunização PBS 6 16,5 ± 3,4 _ SL3261 14,3 ± 2,9 13,3 0,264 SL3261 (pCI-neo) 13,5 ± 2,7 18,2 0,122 SL3261 (pCI-Sm14) 5 12,2 ± 1,8 26,0 0,032* 2º Ensaio de Imunização 7 20,6 ± 8,3 22,3 ± 10 16,7 ± 7,8 18,9 0,388 8 21,5 ± 6,9

22 Número de fêmeas de S. mansoni recuperadas por camundongo experimental
PBS SL pCI-neo pCI-Sm14 PBS SL pCI-neo pCI-Sm14 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

23 Contagens de ovos maduros e imaturos de S
Contagens de ovos maduros e imaturos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos. Estágio dos ovos PBS SL3261 SL3261 (pCI-neo) SL3261 (pCI-Sm14) 1º Ensaio Ovos imaturos/nº de fêmeas recuperadas 751,45 ± 512,21 698,55 ± 566,76 630,75 ± 292,64 573,93 ± 448,13 Ovos maduros/nº de fêmeas recuperadas 201,90 ± 101,46 441,17 ± 497,26 239,20 ± 89,24 325,5 ± 139,01 2º Ensaio 611,83 ± 381,15 993,61 ± 811,77 969,43 ± 556,60 660,77 ± 235,98 200,64 ± 138,49 470,09 ± 571,76 398,71 ± 187,59 303,97 ± 191,21

24 Contagens totais de ovos de S
Contagens totais de ovos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

25 ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORAL PRODUÇÃO DE IgG anti-Sm14
1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO * 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

26 CONCLUSÕES Não é possível afirmar que a imunização oral com a linhagem vacinal confere proteção a camundongos SWISS, após a infecção experimental com cercárias de S. mansoni. A administração da linhagem de S. typhimurium carreadora de vacina de DNA induz produção de anticorpos IgG anti-Sm14 nos camundongos.

27 AGRADECIMENTOS Pai, mãe e irmãos. Amigos de BH (Pterodactilo’s Corporation); Amigos de Sete Lagoas; Carol. Professores Vasco Azevedo e Alan de Melo. Colegas do LGCM, do LTBI e do GIDE. Pessoal do LIDI e do Lab. Imunoparasitologia. Pessoal da Biologia e da Genética.

28 Candidatos vacinais contra a esquistossomose
Antígeno Estágio expresso Propriedade particular Proteção conferida (%) Cam. Rato Outros (GST 28) Todos estágios Enzima 30-60 40-60 40 (primata) (Sm97) Esquistossômulo verme adulto Proteína muscular 30 (IrV-5) 50-70 95 25 (MAP-4) 30-40 Sm23 (MAP-3) Proteína integrada à membrana 40-50 Sm14 Esquistossômulo verme adulto Antígeno de membrana 65 90-100 (coelho)

29 VACINA DE DNA

30 VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

31 MECANISMOS DE TRANSFERÊNCIA DE PLASMÍDEOS VACINAIS POR BACTÉRIAS CARREADORAS
WEISS & CHAKRABORTY, 2001.

32 ALGUMAS VACINAS DE DNA CARREADAS POR SALMONELLA
Linhagem Antígeno Doença Resposta imunológica S. typhimurium aro - Listeriolisina (Listeria monocytogenes) Infecção instestinal Humoral e celular Antígeno de superfície do vírus da hepatite B Hepatite B Glicoproteína D do vírus da herpes Herpes ESAT-6 (Mycobacterium tuberculosis) Tuberculose - Peptídeo NS3 do vírus da hepatite C Hepatite C Celular S. typhimurium aro - HIV-1 Env AIDS

33 1798 1981 1992 Varíola Hepatite B VACINAS DE 1ª GERAÇÃO 2ª GERAÇÃO
VACINAS DE DNA