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Sequenciamento inicial e análises do genoma humano §As fases do século XX: os cromossomos. a dupla hélice de DNA. DNA recombinante e sequenciamento. os.

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1 Sequenciamento inicial e análises do genoma humano §As fases do século XX: os cromossomos. a dupla hélice de DNA. DNA recombinante e sequenciamento. os 1° s genes e genomas decifrados. ( 599 vírus, 205 plasmídios, 185 organelas, 31 eubactérias, 7 arqueobactérias, 1 fungo, 2 animais C. elegans/ Drosóphila, 1 planta Mostarda ).

2 Os 20 grupos colaboradores do projeto: ê EUA, Reino Unido, Japão, França, Alemanha e China. Criação de um mapa físico que cobre 96% da eucromatina. Cobertura do genoma Humano: % cobertura% cobertura meses 90% 10% 15

3 Importância do projeto genoma humano: maior genoma existente. primeiro genoma de vertebrado. nossa espécie. O quê falta? êpreencher gaps. êresolver as ambiguidades.

4 Observações do genoma: êexistem variações nas distribuições dos genes, transposons, conteúdo de GC, ilhas CpG e taxa de recombinação. êexistem mil genes para proteínas. êProteoma é mais complexo (maior n° e combinações de domínios protéicos). ê50% é derivado de transposon, sendo que em humanos eles se encontram destruídos. ê elemento Alu é típico de região rica em GC (efeito de seleção).

5 êtelômeros e centrômeros possuem muitas sequências duplicadas de outras regiões do genoma ( alta frequência em humanos). êa taxa de mutação na meiose em machos é 2X maior que em fêmeas. êas bandas-G em cariótipos estão fortemente relacionadas às regiões ricas em AT. êa taxa de recombinação tende a ser maior nas regiões distais (20Mb) e no braço curto dos cromossomos. êexistem 1,5 milhões de SNPs.

6 Background para o projeto: êFundamentos prontos: mapa físico para organismos modelo (C. elegans e S. cerevisiae) em1980. método de montagem de genoma (vírus SV40). previsão de localização de genes de doenças apenas pelo padrão de herança familial. técnica de sequenciamento shotgun. técnica de sequenciamento único de cDNA automatizado (EST)

7 1995: criação de mapa físico (marcadores) e genético (genes de doenças) para humanos e camundongos. Sequenciamento do draft em 2 etapas: ê shotgun de moléc grandes já mapeadas (recobrimento de 8-10X). ê finishing (acabamento cobrindo gaps e ambiguidades). Qualidade desejada de 99,99%. Projetos pilotos de até março de 1999 já cobriam 15%).

8 Até junho 2000, o draft possuía: ê BACs que cobriam 90% do genoma. ê cobertura de 4-5X (meia cobertura). Estratégia: êsequenciamento shotgun hierárquico (50% é DNA repetitivo). Importância do BAC: nele cada DNA repetitivo é único, possui cópia haplóide (organismo 2n). êtécnica de hashing (juntar quebra-cabeça).

9 Tecnologia: êPHRED ( determina o valor de confiabilidade para cada base). êPHRAP ( junta as sequências usando o valor de qualidade das bases). Coordenação: publicação de 2Kb em 24hs. Sequenciamento compreendendo 4,26 Gb (cobrindo 4,5X o genoma). Ao alinhar o clone draft com o finished observa-se 96% de cobertura e gaps de 500pb.

10 Assembry: ê 3 passos: filtrar: elimina sequências não humanas, vetor(BAC), etc. ordenar: comparam o padrão de digestão virtual com o real (152 perdidos = 5,5Mb). juntar: usando o programa GigAssembler ( considera clones vizinhos, detecta sobreposição entre as pontas dos clones, junta as seq sobrepostas, ordena e orienta as sequências).

11 Existem 3 tipos de gaps no draft: êdentro de clones. êentre os clones, mas dentro de fingerprint clone contings (falha de sequenciamento das pontas). êEntre fingerprint clone contings (falta BACs). Alinhamento do draft com cDNA no programa RefSeq indicou que 88% do genoma humano está representado, sendo que os 12% restantes se referem aos 3 tipos de gaps presentes no draft.


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