Juliana Ramos Pimenta Análises epidemiológicas e populacionais em Trypanosoma cruzi a partir de estudos de microssatélites Orientadora: Prof. Andréa Mara.

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1 Juliana Ramos Pimenta Análises epidemiológicas e populacionais em Trypanosoma cruzi a partir de estudos de microssatélites Orientadora: Prof. Andréa Mara Macedo Co-orientador: Prof. Sérgio Danilo Pena

2 Trypanosoma cruzi A doença de Chagas, causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi pode apresentar diferentes formas clínicas.

3 ? Doença de Chagas Apresentações Clínicas Cardíaca Digestiva
A doença se inicia com uma fase aguda onde com sintomas semelhantes aos de uma gripe; em seguida o paciente entra na fase crônica da doença. A fase crônica pode apresentar diferentes formas clínicas. A forma cardíaca é caracterizada pelo acometimento do tecido cardíaco enquanto pacientes com a forma digestiva geralmente apresentam quadros de megacólon ou megaesôfago. Ou ainda a associação destas duas formas, na forma cardio-digestiva. O paciente pode também apresentar a forma indeterminada, onde não existem sinais claros da doença e muitas o indivíduo nem sabe que foi infectado. Hoje acredita-se que esta variabilidade clínica... Cardíaca Digestiva Indeterminada Cardio-digestiva

4 Fatores determinantes da variabilidade clínica
Está relacionada tanto a características do hospedeiro, como repertório imunológico e pre-disponibilidade genética, quanto a fatores relacionados à genética do parasita. Muitos grupos têm investigado o papel da genética do hospedeiro na doença de Chagas, enquanto nós estamos interessados em avaliar a importância das características genéticas do parasita. Características genéticas do parasita Características genéticas do hospedeiro Características genéticas do parasita

5 Estudos Moleculares Caracterizar geneticamente os parasitas
O nosso principal objetivo então é o de utilizar marcadores moleculares para caracterizar geneticamente os parasitas da espécie T. cruzi e tentar correlacionar as diferenças genéticas entre eles com as diferentes formas clínicas da doença que eles causam. Para isso nós escolhemos como marcador molecular os microssatélites de DNA... Correlacionar com formas clínicas da doença de Chagas

6 Microssatélites de DNA
Os microssatélites são seqüências de DNA contendo repetições de motivos simples, como di, tri e tetra nucleotídeos, que estão espalhados no genoma dos eucariotos e apresentam um alto grau de polimorfismo entre indivíduos devido à sua natureza repetitiva. Este polimorfismo pode ser facilmente detectado...

7 Amplificação de microssatélites (PCR)
alelo A alelo B alelo C AA AB AC BB BC CC através da PCR. Amplificando o DNA das diferentes cepas de T. cruzi, utilizando iniciadores flanqueando a repetição, nós poderemos obter fragmentos de DNA de tamanhos diferentes correspondendo aos diferentes alelos presentes na população. Os microssatélites evoluem rapidamente e por isso são ótimos marcadores para detectar diferenças sutis entre indivíduos e por isso podem ser utilizados em estudos populacionais.

8 Loco Repetição MCLE01 (CA) MCLE08 (CA) AA(CA) SCLE10 (GT) (TG) SCLE11
Microssatélites de T. cruzi Loco Repetição MCLE01 (CA) 9 MCLE08 (CA) AA(CA) 2 12 SCLE10 (GT) (TG) 2 10 SCLE11 (AC) 9 MCLF10 (CA) A (CA) 2 14 Em 1999, a então estudante de doutorado do nosso laboratório, Riva Oliveira, isolou os 8 primeiros locos de microssatélites no genoma de T. cruzi. Estes locos eram compostos de dinucleotídeos de repetições CA. A Tabela mostra os 8 locos descritos e o número e as características das repetições que eles apresentam. Estudos preliminares mostraram um alto polimorfismo destes locos entre as diferentes cepas de T. cruzi indicando que eles poderiam ser utilizados em estudos populacionais. MCLG10 (CA) 8 MCLE03 (CT) (GT) CTAT(GT) 4 2 15 MCLE05 (TC) (GT) 9 4

9 Microssatélites são capazes de traduzir as semelhanças e diferenças entre as cepas de T. cruzi ?
Mas será que

10 ? Trypanosoma cruzi Nomenclatura, 1999 T. cruzi I T. cruzi T. cruzi II
Z1 - Miles, 1977 Tipo III - Andrade, 1974 T. cruzi I Linhagem 2 - Souto, 1996 Grupo 1 - Tibayrenc, 1995 T. cruzi Ribodemas II/III - Clark & Pung, 1994 Tipo I - Andrade Z3 - Miles ZB - Romanha Grupo 1/2 - Souto ? Z2 - Miles, 1977 T. cruzi II ZA - Romanha, 1979 O T. cruzi não é uma espécie homogênea, desde os primeiros estudos moleculares, realizados por Miles em 1977, ficou clara a existência de uma heterogeneidade genética nestes parasitas Posteriormente outros grupos utilizando diferentes marcadores moleculares vieram confirmar estas divergências. Apesar da grande variabilidade genética entre os indivíduos alguns grupos principais puderam ser identificados e em 1999 uma nova nomenclatura para o grupo T. cruzi foi estabelecida. O grupo que se chamou T. cruzi II compreende as amostras relacionadas ao ciclo doméstico do parasita e é onde se encontram a maioria das cepas responsáveis pela infecção humana, enquanto o grupo T. cruzi I é característico de amostras que circulam nos ambientes silvestres. Outras amostras ainda não puderam ser agrupadas em nenhum destas duas linhagens principais e diversos grupos vêm trabalhando para tentar elucidar melhor sua posição taxonômica. Nós nos propusemos então a Tipo II - Andrade, 1974 Linhagem 1 - Souto, 1996 Grupo 2 - Tibayrenc, 1995 Ribodemas I - Clark & Pung, 1994

11 Objetivo 1 Analisar os 8 locos de microssatélites em um grande número de cepas de T. cruzi e investigar as relações filogenéticas entre elas.

12 Análise 131 cepas A - Monoclonal (homozigoto)
B C D A - Monoclonal (homozigoto) B - Monoclonal (heterozigoto) C - Policlonal D - Policlonal Nós analisamos 131 cepas de T. cruzi, extraídas de diferentes hospedeiros e diferentes regiões geográficas para os 8 locos de microssatélites disponíveis. É interessante notar que 35, ou 26%, destas cepas apresentaram mais de 2 picos para pelo menos um loco analisado, sendo consideradas como sendo cepas policlonais. Esta porcentagem aumenta quando analisamos apenas cepas extraídas de hospedeiros não humanos e aumenta ainda mais quando analisamos apenas as cepas pertencentes ao grupo Z3 de Miles. As cepas policlonais foram excluídas das análises filogenéticas posteriores. Utilizando a diferença entre os tamanhos dos alelos como medida da distância genética entre as cepas, nós utilizamos o pacote de programas PHYLLIP para construir uma árvore filogenética... Monoclonal Policlonal Total Humanos 62 (80%) 16 (20%) 78 Não Humanos 28 (67%) 14 (33%) 42 6 (55%) 5 (45%) 11 TOTAL 96 (74%) 35 (26%) 131 Z3 4 (34%) 8 (66%) 12 ?

13 rDNA 2 mini-exon 1 T. Cruzi I T. Cruzi II Árvore 97 cepas
84 GMS 237 229A3 Esmeraldo EGB 1043 CPI95/94 169/1 183744 580 Mas1cl1 Tu18cl93 JSM 461 NHR DSR 209 226 RTL WG 200pm PFPI58/94 OPS27/94 GLT593 GLT564 JHF JG JAF DogTheis RBVIX 803 402 84Ti 1931 MPD Be62 Gil 239 103894 578 577 GOCH 581 Ig539 JDS NO Ig62 1005 LPS 207 182 MC JLB 1014 IVV CLBrener CPI11/94 Y 115 Tulacl2 167 1022 231 3869 222 M5631cl5 3663 4182 M6241cl6 SC43 SO3 NR Sc43cl1 Mncl2 Basileu CanIIIcl1 SC13 Gambacl1 X10cl1Z1 Cuicacl1 Cutiacl1 1004 GLT600 RBI 1006 RBVI 1502 A87 D7 RBII SE 1523 Col18/05 Colombiana 1001 T. Cruzi II A topologia geral da árvore mostra uma clara divisão entre os dois grupos principais propostos por rDNA, um compreendendo as amostras do ciclo silvestre, apresentando rDNA do tipo 2 e outro as amostras de pacientes: rDNA tipo1. Estes dados mostram que os microssatélites são sensíveis suficientes para diferenciar entre as diversas cepas de T. cruzi mas ainda assim são capazes de identificar as semelhanças entre os indivíduos mais relacionados, como nos 2 gruposprincipais: T. cruziI e T. cruzi II. No entanto nós observamos ainda um terceiro grupo formado por uma mistura de cepas do grupo T. cruzi I e cepas de rDNA ½ e que se encontra mais próximo ao grupo T. cruzi II. É interessante notar que estas cepas são exatamente as que apresentam uma incongruência nas ánalises por outros marcadores, com rDNA do tipo 2, porém mini-exon do tipo 1, enquanto um T. cruzi I típico apresenta rDNA e mini exon do tipo 1. Este resultado é interessante porque está de acordo com dados recentes encontrados por outros pesquisadores utilizando outros marcadores e indica que a história filogenética do grupo T. cruzi pode ser mais complexa do que se imaginava. Esta primeira etapa do trabalho foi concluída e estes resultados foram publicados... rDNA 1 rDNA 2 rDNA 1/2

14 Bom, depois de termos visto que os microssatélites são ótimos marcadores para evidenciar as relações entre os T. cruzi, nós os utilizamos para tentar responder a questão principal ...

15 Diferentes formas clínicas
Diferentes parasitas Diferentes formas clínicas Será que as diferentes formas clínicas ocorrem porque os pacientes estão infectados com parasitas diferentes? E será que nós seremos capazes de fazer uma correlação do tipo: parasitas do tipo X causam a forma cardíaca, parasitas do tipo Y causam forma digestiva e assim por diante? Muitos pesquisadores têm tentado responder a estas perguntas, mas por enquanto ninguém ainda obteve sucesso.

16 Modelo Histotrópico Clonal da Doença de Chagas
Parasitas disponíveis para análise Infecção policlonal REDUÇÃO POPULACIONAL Análises diretamente dos tecidos Uma explicação plausível para esta ausência de correlação está no modelo histotrópico clonal da doença de Chagas. Segundo ele, quando um barbeiro infectado com uma mistura de cepas de T. cruzi entra em contato com o homem, nem todos os parasitas que ele transmite são capazes de estabelecer a infecção em um hospedeiro vertebrado. Os clones que conseguem se estabelecer, provavelmente competem entre si e colonizam tecidos diferentes deste paciente. O isolamento de uma cepa de um paciente geralmente é feito através do sangue e pode ser que as cepas presentes no sangue deste paciente não sejam as mesmas que estão infectando os tecidos. Posteriormente, o cultivo e a manutenção destas cepas em laboratório pode selecionar clones mais adaptados aos meios de cultura. Isto resulta em uma redução populacional em três pontos, fazendo com que os parasitas disponíveis para a análise provavelmente não sejam os mesmos que estão infectando os diversos tecidos e muito menos os responsáveis pela infecção inicial. Não é de se admirar então que até hoje ninguém tenha achado uma correlação entre o parasita extraído do paciente e a forma clínica da doença que ele apresenta. O ideal seria, utilizar uma técnica que fosse capaz de estudar o parasita diretamente no tecido do paciente, evitando-se assim as etapas de redução populacional. Porém, o problema é que, na fase crônica da doença de Chagas, há uma baixa parasitemia, ou seja, é difícil encontrar o parasita nos tecidos do paciente. Seria necessária então uma técnica muito sensível, capaz de detectar um número muito pequeno de parasitas. Uma técnica que já foi utilizada com sucesso para este fim foi o LSSP-PCR. Manutenção de parasitas in vitro Nem todos os clones são capazes de estabelecer infecção Isolamento

17 Vantagens Desvantagens Marcadores unilocais específicos
LSSP-PCR em tecidos de camundongos infectados Col1.7G2 Cor Reto Diaf Esof San JG Vantagens Capaz de detectar DNA do parasita nos tecidos. Dirigido ao kDNA. Desvantagens Dirigido ao kDNA. Perfil aleatório complexo que não corresponde a amplificação de 1 único loco. Análises de LSSP PCR diretamente em tecidos de camundongos infectados com uma mistura de populações de T. cruzi mostraram não só a detecção do DNA do parasita, mas também perfis de amplificação diferentes nos diferentes tecidos. Uma outra vantagem do LSSP-PCR é que ele está dirigido ao kDNA que é uma molécula naturalmente amplificada, o que aumenta a sensibilidade da técnica. Porém, ao mesmo tempo, ter o kDNA como alvo é uma desvantagem, já que estamos tentando correlacionar o parasita com a forma clinica da doença e com certeza, as principais características envolvidas nesta modulação devem estar no DNA nuclear. Além disso o perfil complexo gerado pela amplificação aleatória dificulta a clara identificação de quantas e quais cepas são responsáveis pela infecção. O ideal seria a utilização de marcadores unilocais específicos e suficientemente sensíveis para detectar sem dúvida qual cepa é responsável pela infecção. Marcadores como os microssatélites. Marcadores unilocais específicos

18 Microssatélites de DNA
Porém surge uma dificuldade. Como os microssatélites são marcadores unilocais e na fase crônica da doença de Chagas existem poucos parasitas nos tecidos, precisamos utilizar uma estratégia capaz de aumentar muito a sensibilidade da PCR de microssatélites. Uma alternativa é o uso da PCR nested...

19 Full-nested PCR 5’ 3’ DNA molde inicial 5’ 3’ 1a amplificação 3’ 5’ 3’
ATAATAATAATAATAATA 5’ 3’ TATTATTATTATTATTAT DNA molde inicial Primer externo F ATAATAATAATAATAATA 5’ 3’ TATTATTATTATTATTAT Primer externo R 1a amplificação ATAATAATAATAATAATA 3’ TATTATTATTATTATTAT 5’ Primer int. F Primer int. R 3’ 2a amplificação No nested PCR são feitas duas rodadas de amplificação específica. Na primeira rodada são utilizados iniciadores flanqueando a repetição. 10% do produto do 1o round são utilizados como molde para o segundo round de PCR, desta vez utilizando iniciadores flanqueando a repetição mas posicionados de uma maneira mais interna em relação aos primeiros. Nós tínhamos então 8 locos de di-nucleotídeos disponíveis, porém, por uma limitação da técnica pela qual eles foram selecionados, havia poucas sequencias flanquadoras disponiveis, o que impossibilitou o desenho de dois pares de iniciadores para a PCR full nested. Por isso tornou-se necessária a procura por novos locos, então, o nosso segundo objetivo foi: 5’ ATAATAATAATAATAATA 5’ 3’ TATTATTATTATTATTAT Produto final

20 Objetivo 2 Isolar e caracterizar novos locos de microssatélites no genoma do T. cruzi.

21 Identificação dos locos de microssatélites
Lançando mão do projeto genoma de T. cruzi que vem depositando um grande número de sequencias em bancos de dados, nós utilizamos o programa Tandem repeats finder, que está disponível na rede, para procurar por novos microssatélites em T. cruzi. O programa é muito simples, basta copiar e colar a sequencia de interesse na janela do programa que ele te retorna uma tabela...

22 Identificação dos locos de microssatélites
TcAAT-01 TcAAAT-01 Onde estão discriminadas todas as sequencias repetitivas que ele encontrou, bem como a posição, o motivo de repetição, número de cópias e se elas são perfeitas ou não. Nós selecionamos 8 locos de microssatélites de repetições de tri ou tetranucleotídeos, desenhamos dois pares de iniciadores para cada um e testamos o full nested PCR. TcTAC-02 8 locos de microssatélites selecionados TcAAT-01 TcAAAT-01 TcTAC-01 TcTAT-01 TcATA-01 TcTGTC-01 TcATT-01 TcTAC-02

23 Resultados full-nested PCR
TcTAT-01 1a amplificação 2a amplificação Full nested Este é um resultado tipico, obtido para o loco TCTAT-01, onde amplificamos diluições seriadas de DNA de T. cruzi, partindo de 10pg de DNA até 1 fg. O controle positivo com 1ng de DNA e o branco. Podemos ver que quando utilizamos apenas a primeira amplificação só somos capazes de detectar produtos acima de 10pg de DNA. So a segunda amplificação é capaz de gerar produtos detectáveis com 1pg de DNA, mas a associação dos dois rounds de PCR é capaz de amplificar DNA partindo de 100fg de DNA, o que corresponderia ‘a quantidade de DNA de um único T. cruzi. 100 fg DNA

24 Caracterização dos novos locos
TcAAT-01 TcAAAT-01 TcTAC-01 TcTAT-01 Análises de 36 cepas de T. cruzi. Número de Alelos Equilíbrio de Hardy-Weinberg Para caracterizar os novos locos, nós estamos amplificando o DNA de 36 cepas de T. cruzi de diferentes hospedeiros e áreas geográficas. Destes 4 locos já caracterizados o AAT foi o que se mostrou mais polimórfico, com aproximadamente 18 alelos na população, enquanto o AAAT foi o menos polimórfico, com menos de 10 alelos. Calculando a heterozigozidade esperada e observada para estes locos podemos ver que a heterozigozidade observada foi sempre menor que a esperada, demonstrando que estas populações não estão em equilíbrio de hardy-weinberg. Análises de desequilíbrio de ligação entre todas as combinações par a para dos locos estudados mostraram um alto coeficiente de correlação indicando que estes locos estão ligados. Estes dados estão de acordo com a idéia de evolução predominantemente clonal para o grupo T. cruzi. Bom, uma vez padronizada a PCR full nested de microssatélites, nós partimos para o 3o objetivo... Desequilíbrio de ligação

25 Objetivo 3 Otimizar a amplificação de locos de microssatélites de T. cruzi diretamente em amostras de tecidos chagásicos.

26 Infecções experimentais
(50+50 tripomastigotas) Col1.7G2 + JG Para isto nós utilizamos tecidos de camundongos BALB C infectados com uma mistura equimolar de duas populações monoclonais de T. cruzi, o clone da cepa colombiana Col1.7G2 e a cepa JG. Estes camundongos haviam sido sacrificados após seis meses de infecção, que corresponderiam à fase crônica da doença, e os tecidos já haviam sido submetidos à lise alcalina e analisados por LSSP-PCR. Nós utilizamos uma alíquota da lise alcalina para a PCR full nested de microssatélites. 6 meses Reto Coração

27 Resultados Amplificação em tecidos de camundongos infectados experimentalmente com T. cruzi. LSSP-PCR Microssatélites Este gel mostra a amplificação por LSSP-PCR dos corações e retos de 3 camundongos infectados com a misturas. Mostrando perfis de amplificação diferentes nos diferentes tecidos. Este gel mostra a amplificação pra 3 locos de microssatélites dos tecidos destes mesmos camundongos. Nós conseguimos detectar produto de amplificação direta nos tecidos porém, nota-se logo que alguns locos são mais sensíveis que outros. O loco AAAT foi capaz de detectar a presença de DNA de parasitas tanto nos corações quanto nos retos dos camundongos, enquanto que os outros dois locos só foram capazes de amplificar o DNA nos corações. Uma possível explicação para este fato é de que os retos apresentem níveis de parasitismo menores que os corações e sendo assim apenas locos muito sensíveis seriam capazes de detectar a presença de DNA neste órgão. Isto torna cada vez mais importante o isolamente de vários outros locos na tentativa de encontrar um bom número de locos sensíveis o suficiente para detectar DNA de parasitas em quaisquer tecidos infectados. Se analisarmos só o loco AAAT, podemos notar que os produtos de amplificação de tamanhos diferentes nos corações e retos dos camundongos, sendo o padrão no coração semelhante ao da cepa JG e no reto ao clone col1.7G2, o que está perfeitamente de acordo com os resultados obtidos por LSSP-PCR.

28 Resultados Perfis dos microsatélites amplificados nos tecidos dos camundongos e analisados no sequenciador automático ALF. Isto pode ser melhor visualizado se analisarmos as curvas obtidas no sequenciador automático e compararmos os valores dos picos obtidos nos tecidos aos tamanhos dos picos característicos de JG e Col 1.7G2. Nós avaliamos também a amplificação de microssatélites em tecidos de pacientes... Tamanhos dos alelos detectados nos tecidos X alelos apresentados pelas cepas originais utilizadas na infecção mista inicial.

29 Tecidos de pacientes (1:10)
Resultados preliminares em tecidos humanos TcTAT-01 Tecidos de pacientes (1:10) DNA hum. DNA T.cruzi Nossos resultados preliminares mostram que é possível amplificar especificamente DNA de T. cruzi em tecidos humanos. Neste gel podemos ver a amplificação de DNA humano de indivíduo não infectado, e nas canaletas 3 a 9 a amplificação em fragmentos de esôfago de pacientes submetidos ‘a cirurgia corretiva no hospital escola da faculdade de medicina do triângulo mineiro. Na canaleta 9 um DNA de T. cruzi como controle e na canaleta 10 o controle negativo sem DNA. Por enquanto nós só amplificamos tecidos humanos com 2 locos, mas uma característica interessante que tem surgido é uma homogeneidade dos perfis amplificados em pacientes diferentes, indicando que pode ser que as infecções humanas sejam causadas por apenas por um tipo de T. cruzi mas ainda estamos trabalhando para confirmar estes resultados. A caracterização dos novos locos e os resultados obtidos nos tecidos foram reunidos em um outro artigo...

30 Que esta sendo submetido ‘a Parasitology.
Uma vez padronizada a reação de PCR de microssatélites para pequenas quantidades de DNA, nós podemos utilizar esta metodologia para responder uma outra questão:

31 Como é estrutura das populações de T. cruzi ?

32 Infecções policlonais de T. cruzi
Ciclo silvestre Ciclo doméstico

33 Análises populacionais das cepas de T. cruzi
Quantos clones formam uma cepa multiclonal? Estes clones compartilham características ou são heterogêneos? Existe possibilidade de recombinação genética entre os clones?

34 Análises populacionais das cepas de T. cruzi
Isolado de um paciente CEPA (JU24) JU24- Clone1 JU24- Clone2 CEPA JU24

35 Objetivo 4 Otimizar a amplificação de locos de microssatélites em células únicas de T. cruzi separadas através de FACS Vantage.

36 Separação das células únicas através do FACS Epimastigotas de T. cruzi
Fluorescence Activated Cell Sorter Epimastigotas de T. cruzi Para desenvolver esta técnica, por enquanto a gente vem trabalhando com misturas artificiais de clones. Nós utilizamos inicialmente uma cultura de formas epimastigotas de dois ou mais clones conhecidos. Fazemos misturas artificiais contendo a mesma quantidade de células cada um dos clones. (aperta) E separamos utilizando um aparelho chamado FACS ou Fluorescent Activated Cell Sorter. Quando submetemos células epimastigotas de T. cruzi ao FACS, o aparelho detecta a autofluorescência que as células emitem e as indica no computador como pontos em um gráfico de flourescência versos tamanho da célula. Neste gráfico podemos ver o perfil gerado pelas células de uma cepa de T. cruzi. Nós selecionamos a área que contém o tamanho de célula e intensidade de fluorescência que nos interessa e falamos para o aparelho que, toda vez que uma célula com estas características passar pelo seu detector laser, ele deve separá-la em um tubo ou placa que nós acoplamos ao aparelho. Funciona da seguinte forma (aperta) O aparelho suga a suspensão contendo a mistura de células que nós preparamos e as despeja por um caninho fininho. No início deste caninho tem um dispositivo chamado nozzle que vibra de maneira constante, o que faz com que o líquido forme gotas de tamanho tal que possam conter apenas uma célula. Quando uma gota, contendo uma célula de interesse, passa por um laser que detecta sua fluorescência, um sinal é enviado ao computador que manda uma descarga elétrica fazendo com que esta gota se torne carregada. Quando a gota sai pelo cano, ela passa por entre duas placas eletricamente carregadas. Se a gota estiver carregada positivamente, será atraída pela placa carregada negativamente e será desviada para a esquerda, por exemplo, caindo no tubinho da esquerda. Se estiver carregada negativamente cairá no tubinho da diretita. Se a gota não estiver carregada, cai no meio, no tubinho lixo. Desta forma podemos separar, por exemplo, duas populações celulares com fluorescências diferentes. Mas no nosso caso, nós substituímos os tubinhos por uma placa de 96 wells e programamos o aparelho para depositar uma única célula de interesse em cada well.

37 PCR microssatélites Epimastigotas de T. cruzi
Fluorescence Activated Cell Sorter Microplacas de 96 wells Epimastigotas de T. cruzi Separação das células únicas através do FACS PCR microssatélites Sequenciador automático de DNA O aparelho então coloca uma célula de T. cruzi em cada well que já contém um tampão de lise, nós submetemos a plaquinha ao calor pra que as células arrebentem liberando o DNA, colocamos o mix de PCR contendo DNTP, os iniciadores, tampão e a enzima taq DNA polimerase e fazemos a PCR de microssatélites diretamente na plaquinha. Após a amplificação das células, nós verificamos o produto de amplificação através de eletroforese em gel e estabelecemos o tamanho dos alelos através do sequenciador automático de DNA. Eletroforese

38 Controle da clonagem A - Well programado para conter 5 esferas
B - Well programado para conter 1 esfera C - Well programado para conter 2 esferas

39 Resultados 1 - Well programado para conter 1 célula
3 - DNA de JG 4 - DNA de Colombiana

40 PCR Multiplex dos locos de microssatélites em células únicas
1o round TcAAT-01 TcAAAT-01 TcTAT-01 2o round

41 PCR Multiplex dos locos de microssatélites em células únicas
Perfis dos microsatélites amplificados nas células únicas de T. cruzi analisados no sequenciador automático ALF. Tamanhos dos alelos detectados X alelos das cepas originais utilizadas na clonagem mista inicial.

42 Amplificação da cepa 4176 – TcAAAT-01 e TcTAC-02

43 Principais Conclusões
Análises de microssatélites foram capazes de discriminar entre as cepas de T. cruzi mas também identificaram as semelhanças entre elas, em concordância com outros marcadores moleculares. Foram identificados 8 novos locos de microssatélites polimórficos no genoma de T. cruzi. Foram padronizadas reações de PCR nested para os novos locos de microssatélites de T. cruzi que foram sensíveis o bastante para detectar DNA do parasita diretamente em tecidos infectados de camundongos e humanos. Foi padronizada a técnica capaz de amplificar microssatélites em células únicas de T. cruzi separadas por FACS cell sorter.

44 Colaboradores Dr. Egler Chiari, Afonso e Orlando (Dep. Parasitologia, ICB/UFMG) Dr. Octávio Fernandes e Regina Mangia (FIOCRUZ, RJ) Dra. Bianca Zingales (USP, SP) Dr. Michel Tybairenc (Montpellier, França) Dra. Riva de Paula Oliveira e Helder (UFOP) Dr. Olindo Martins Filho (CPqRR) Dra. Eliane Lages (Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro) Dra. Santuza Teixeira, Dra. Maria de Fátima Horta, e o pessoal do laboratório Funcionários: Neuza, Kátia, Míriam e Cássio Povo do LGB

45 Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG
LGB Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG “Grupo dos Cruzi” Juliana E o Charles... Jorge Renato Simone Prof. Andréa Macedo