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Análises epidemiológicas e populacionais em Trypanosoma cruzi a partir de estudos de microssatélites Juliana Ramos Pimenta Orientadora: Prof. Andréa Mara.

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2 Análises epidemiológicas e populacionais em Trypanosoma cruzi a partir de estudos de microssatélites Juliana Ramos Pimenta Orientadora: Prof. Andréa Mara Macedo Co-orientador: Prof. Sérgio Danilo Pena

3 Trypanosoma cruzi

4 Apresentações Clínicas Doença de Chagas CardíacaDigestivaIndeterminada ? Cardio-digestiva

5 Fatores determinantes da variabilidade clínica Características genéticas do hospedeiro Características genéticas do parasita

6 Estudos Moleculares Correlacionar com formas clínicas da doença de Chagas Caracterizar geneticamente os parasitas

7 Microssatélites de DNA

8 AA ABACBBBCCC Amplificação de microssatélites (PCR) alelo A alelo B alelo C

9 Microssatélites de T. cruzi LocoRepetição MCLE01(CA) 9 MCLE08(CA) 2 AA(CA) 12 SCLE10(GT) 2 (TG) 10 SCLE11(AC) 9 MCLF10(CA) 2 A (CA) 14 MCLG10(CA) 8 MCLE03(CT) 4 (GT) 2 CTAT(GT) 15 MCLE05(TC) 9 (GT) 4

10 Microssatélites são capazes de traduzir as semelhanças e diferenças entre as cepas de T. cruzi ?

11 Nomenclatura, 1999 Trypanosoma cruzi T. cruzi T. cruzi I T. cruzi II Tipo III - Andrade, 1974 Linhagem 2 - Souto, 1996 Z1 - Miles, 1977 Grupo 1 - Tibayrenc, 1995 Ribodemas II/III - Clark & Pung, 1994 Tipo II - Andrade, 1974 Linhagem 1 - Souto, 1996 Z2 - Miles, 1977 Grupo 2 - Tibayrenc, 1995 Ribodemas I - Clark & Pung, 1994 ZA - Romanha, 1979 Tipo I - Andrade Z3 - Miles ZB - Romanha Grupo 1/2 - Souto ?

12 Analisar os 8 locos de microssatélites em um grande número de cepas de T. cruzi e investigar as relações filogenéticas entre elas. Objetivo 1

13 A B CD C - Policlonal D - Policlonal A - Monoclonal (homozigoto) B - Monoclonal (heterozigoto) MonoclonalPoliclonalTotal Humanos 62 (80%)16 (20%)78 Não Humanos 28 (67%)14 (33%)42 6 (55%)5 (45%)11 TOTAL 96 (74%)35 (26%)131 Z3 4 (34%)8 (66%)12 ? Análise 131 cepas

14 Árvore 97 cepas T. Cruzi II T. Cruzi I rDNA 1/2 rDNA 2 rDNA 1 rDNA 2 mini-exon 1

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16 Diferentes parasitas Diferentes formas clínicas

17 Modelo Histotrópico Clonal da Doença de Chagas Infecção policlonal Manutenção de parasitas in vitro Parasitas disponíveis para análise Nem todos os clones são capazes de estabelecer infecção Isolamento Análises diretamente dos tecidos REDUÇÃO POPULACIONAL

18 Col1.7G2 Cor Reto Diaf Esof SanJG LSSP-PCR em tecidos de camundongos infectados Capaz de detectar DNA do parasita nos tecidos. Dirigido ao kDNA. Perfil aleatório complexo que não corresponde a amplificação de 1 único loco. Vantagens Desvantagens Marcadores unilocais específicos

19 Microssatélites de DNA

20 Full-nested PCR ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 DNA molde inicial Primer externo F ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 Primer externo R 5 3 ATAATAATAATAATAATA 3 TATTATTATTATTATTAT 5 Primer int. F Primer int. R ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 1 a amplificação 2 a amplificação Produto final

21 Isolar e caracterizar novos locos de microssatélites no genoma do T. cruzi. Objetivo 2

22 Identificação dos locos de microssatélites

23 8 locos de microssatélites selecionados TcAAT-01TcTAC-01TcAAAT-01TcTAT-01 TcTAC-02 TcAAT-01 TcAAAT-01 TcATA-01TcTAC-02TcATT-01TcTGTC-01

24 Resultados full-nested PCR 1a amplificação2a amplificaçãoFull nested 100 fg DNA TcTAT-01

25 Caracterização dos novos locos Análises de 36 cepas de T. cruzi. TcAAT-01 TcTAC-01 TcAAAT-01 TcTAT-01 Número de Alelos Desequilíbrio de ligação Equilíbrio de Hardy-Weinberg

26 Otimizar a amplificação de locos de microssatélites de T. cruzi diretamente em amostras de tecidos chagásicos. Objetivo 3

27 6 meses Col1.7G2 + JG (50+50 tripomastigotas) RetoCoração Infecções experimentais

28 Microssatélites Resultados Amplificação em tecidos de camundongos infectados experimentalmente com T. cruzi. LSSP-PCR

29 Resultados Perfis dos microsatélites amplificados nos tecidos dos camundongos e analisados no sequenciador automático ALF. Tamanhos dos alelos detectados nos tecidos X alelos apresentados pelas cepas originais utilizadas na infecção mista inicial.

30 DNA hum. Tecidos de pacientes (1:10) DNA T.cruzi Resultados preliminares em tecidos humanos TcTAT-01

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32 Como é estrutura das populações de T. cruzi ? Como é estrutura das populações de T. cruzi ?

33 Ciclo silvestre Ciclo doméstico Infecções policlonais de T. cruzi

34 Análises populacionais das cepas de T. cruzi Existe possibilidade de recombinação genética entre os clones? Quantos clones formam uma cepa multiclonal? Estes clones compartilham características ou são heterogêneos?

35 Isolado de um paciente CEPA (JU24) JU24- Clone1 JU24- Clone2 JU24 Análises populacionais das cepas de T. cruzi

36 Otimizar a amplificação de locos de microssatélites em células únicas de T. cruzi separadas através de FACS Vantage. Objetivo 4

37 Epimastigotas de T. cruzi Separação das células únicas através do FACS Fluorescence Activated Cell Sorter

38 Separação das células únicas através do FACS Microplacas de 96 wells Epimastigotas de T. cruzi PCR microssatélites Eletroforese Sequenciador automático de DNA Fluorescence Activated Cell Sorter

39 Controle da clonagem A - Well programado para conter 5 esferas B - Well programado para conter 1 esfera C - Well programado para conter 2 esferas

40 Resultados 1 - Well programado para conter 1 célula 2 - Well programado para conter 1 célula 3 - DNA de JG 4 - DNA de Colombiana

41 PCR Multiplex dos locos de microssatélites em células únicas 1 o round TcAAT-01 TcAAAT-01 TcTAT-01 2 o round TcAAT-01 TcAAAT-01 TcTAT-01

42 PCR Multiplex dos locos de microssatélites em células únicas Perfis dos microsatélites amplificados nas células únicas de T. cruzi analisados no sequenciador automático ALF. Tamanhos dos alelos detectados X alelos das cepas originais utilizadas na clonagem mista inicial.

43 Amplificação da cepa 4176 – TcAAAT-01 e TcTAC-02

44 Análises de microssatélites foram capazes de discriminar entre as cepas de T. cruzi mas também identificaram as semelhanças entre elas, em concordância com outros marcadores moleculares. Foram padronizadas reações de PCR nested para os novos locos de microssatélites de T. cruzi que foram sensíveis o bastante para detectar DNA do parasita diretamente em tecidos infectados de camundongos e humanos. Principais Conclusões Foram identificados 8 novos locos de microssatélites polimórficos no genoma de T. cruzi. Foi padronizada a técnica capaz de amplificar microssatélites em células únicas de T. cruzi separadas por FACS cell sorter.

45 Colaboradores Dr. Egler Chiari, Afonso e Orlando (Dep. Parasitologia, ICB/UFMG) Dr. Octávio Fernandes e Regina Mangia (FIOCRUZ, RJ) Dra. Bianca Zingales (USP, SP) Dr. Michel Tybairenc (Montpellier, França) Dra. Riva de Paula Oliveira e Helder (UFOP) Dra. Santuza Teixeira, Dra. Maria de Fátima Horta, e o pessoal do laboratório Funcionários: Neuza, Kátia, Míriam e Cássio Povo do LGB Dra. Eliane Lages (Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro) Dr. Olindo Martins Filho (CPqRR)

46 Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG Grupo dos Cruzi Jorge Simone Renato Prof. Andréa Macedo Juliana E o Charles...


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