O Papel da Genética do Parasita na Doença de Chagas

Apresentação em tema: "O Papel da Genética do Parasita na Doença de Chagas"— Transcrição da apresentação:

1 O Papel da Genética do Parasita na Doença de Chagas
Boa tarde! Eu gostaria de agradecer o convite e a oportunidade de vir aqui mostrar um pouco do trabalho que nós vimos desenvolvendo no grupo de T. cruzi do laboratório de genética-bioquímica da UFMG. Vocês acabaram de ver, na ótima apresentação da Andréia a aplicação das técnicas de biologia molecular em estudos de humanos. Bom, agora eu vou mostrar para vocês um pouco da aplicação destas mesmas metodologias no estudo do parasita Trypanosoma cruzi. Eu vou mostrar um pouco do trabalho que vem sendo desenvolvido pelo nosso grupo na tentativa de entender melhor o papel da genética do parasita na doença de Chagas. Juliana Ramos Pimenta LGB Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG

2 A doença de Chagas foi descrita em 1909 por um grande cientista brasileiro, Carlos Justiniano Chagas, que quase ganhou o prêmio Nobel. Na verdade ele estava estudando a malária quando se deparou com um parasita diferente. Ele chamou esta nova espécie de Trypanosoma cruzi em homenagem a Oswaldo Cruz e descreveu, já naquela época, detalhadamente todo o ciclo de vida do parasita e a doença que levou seu nome.

3 Doença de Chagas Distribuição  Prevalência:
16 a 18 milhões de infectados (WHO, 1991)  Formas de transmissão:  Transmissão vetorial  Transmissão transfusional  Transmissão congênita  Formas excepcionais de transmissão A doença de Chagas, ou tripanosomíase americana, é um mal restrito ao continente americano afetando quase a totalidade da américa do sul,toda américa central e parte da américa do norte. Hoje estima-se que 16 a 18 milhões de pessoas estejam infectadas. Esta única área da américa do sul onde não aparecem casos humanos da doença corresponde ao interior da selva amazônica, uma área praticamente desabitada. A forma mais comum de transmissão da doença de Chagas é a transmissão vetorial, ou seja, através do inseto infectado. Este tipo de transmissão tem sido controlada através do uso de inseticidas sendo que inclusive, no ano passado, o Brasil foi considerado pela Organização mundial de Saude como país livre da transmissão vetorial da doença de Chagas. As outras formas de transmissão são por transfusões sanguineas, transmissão congênita e outras formas excepcionais, como acidentes de laboratório e ingestão de alimentos contaminados.

4 Quando então o barbeiro infectado pica o homem, ele deposita suas fezes contendo o parasita sobre a pele. Ao coçar o local da picada, o homem se infecta dando início à fase aguda da doença de Chagas.

5 miocardites/encefalites agudas
Doença de Chagas Fase Aguda alta parasitemia alto parasitismo tissular edema periorbital (1-2%) sintomas leves miocardites/encefalites agudas A fase aguda pode ser caracterizada pela presença de um edema periorbital, também chamado sinal de Romaña ou sinal de porta de entrada, que ocorre em 1 a 2% dos casos. Nesta fase, é possível encontrar um grande número de parasitas circulantes e nos tecidos do paciente. A grande maioria dos pacientes apresenta sintomas leves, como de uma gripe, mas em alguns casos raros podem ocorrer miocardites ou encefalites agudas que podem levas à morte. Seguindo a fase aguda da doença, o paciente entra na fase crônica...

6 ? Doença de Chagas Fase Crônica nenhum sinal aparente
Cardíaca Digestiva Indeterminada ? Cardio-digestiva Fase Crônica nenhum sinal aparente baixa parasitemia baixo parasitismo tissular A fase crônica se caracteriza por uma ausência de sinais aparentes da infecção, com uma baixa parasitemia e baixo parasitismo nos tecidos. A fase crônica pode se estender por toda a vida do paciente e pode apresentar diferentes manifestações clínicas. Na forma digestiva da doença de Chagas, há um acometimento da musculatura lisa do trato digestivo. Neste slide nós temos uma foto de um raio-X de um paciente apresentando megaesôfago. A outra forma comum da doença de Chagas é a forma cardíaca onde o parasita se aloja nas células do coração causando uma inflamação do músculo cardíaco. Esta inflamação leva a um aumento no tamanho do coração que acarreta uma insuficiência cardíaca que muitas vezes leva à morte precoce do indivíduo. Uma forma mais rara é a forma cardio-digestiva onde há a associação dessas duas formas. Porém, a forma mais comum da doença de Chagas é conhecida como forma indeterminada. Neste caso, o paciente passa toda sua vida sem apresentar nenhum sintoma da doença e muitas vezes nem sabe que está infectado, morrendo posteriormente de outras causas. Estas diferentes formas da doença de chagas são, com certeza, o resultado da interação de características do hospedeiro (como repertório imunológico etc) e características intrínsecas ao parasita. O parasita causador da doença de Chagas, é o diferentes formas

7 Trypanosoma cruzi Trypanosoma cruzi.
O T. cruzi é um protozoário flagelado, da família tripanosomatidade, da ordem kinetoplastidae. Os membros desta ordem se caracterizam pela presença de uma organela denominada cinetoplasto que possui um DNA próprio, extranuclear. De acordo com a posição do cinetoplasto em relação ao núcleo e apresença ou não de flagelo visível, foram identificadas três formas básicas do parasita durante seu ciclo de vida...

8 Trypanosoma cruzi Formas do parasita Amastigota Tripomastigota
A forma amastigota é uma forma arredondada e que possui um flagelo internalizado. É a forma replicativa no interior das células do hospedeiro mamífero. A forma tripomastigota é uma forma alongada com a presença de flagelo e com o cinetoplasto em posição posterior ao núcleo da célula. Esta forma se encontra livre no sangue do hospedeiro vertebrado e é a forma infectante. Finalmente temos a forma epimastigota, também alongada e com flagelo, porém o cinetoplasto está localizado anteriormente ao núcleo. Estaé a forma que se replica no interior do trato digestivo do inseto vetor. O ciclo de vida do parasita Amastigota Tripomastigota Epimastigota 1.5 a 5  10 a 20  10 a 20 

9 Tem início quando o barbeiro entra em contato com o hospedeiro vertebrado, neste caso o homem. Os tripomastigotas metacíclicos caem na corrente sangüínea e são capazes de infectar virtualmente qualquer tipo de célula nucleada. No interior das células eles se diferenciam em amastigotas que se dividem assexuadamente até romperem a célula. Quando caem na corrente sangüínea, os parasitas se diferenciam para a forma tripomastigota e podem, ou infectar novas células, ou serem sugadas por um outro barbeiro durante o repasto sangüíneo. Dentro do trato digestivo do inseto, eles se diferenciam para a forma epimastigotas que também se replicam assexuadamente e depois em tripomastigotas metacíclicos, que serão depositados nas fezes podendo infectar outro hospedeiro, fechando o ciclo. Agora eu gostaria dereforçar dois conceitos básicos em parasitologia que serão importantes durante este seminário. Os conceitos de cepa e clone.

10 Cepas X Clones CEPA Isolado de um paciente (MC43) CEPA MC43
MC43- Clone1 Quando isolamos o parasita, geralmente através do sangue de uma pessoa, animal ou inseto infectado, nós chamamos este isolado de cepa. Neste caso aqui, para exemplificar, eu chamei esta cepa de MC43, porque ela foi isolada em montes claros do paciente número 43. A partir desta cepa, é feita uma cultura, os parasitas são contados e são feitas diluições de modo que haja provavelmente um único parasita em cada cultura. Este parasita então, em um meio apropriado, vai se multiplicar assexuadamente, ou clonalmente, por isso nós chamamos de um clone da cepa. Cada clone recebe um nome diferente e tanto a cepa quanto seus clones são congelados e guardados para estudo. Notem então que a cepa é a população original de parasitas extraída do hospedeiro e os clones são populações derivadas desta cepa original. Os clones podem ser iguais ou diferentes entre si, uma vez que MC43- Clone2 CEPA MC43- Clone3 MC43

11 Trypanossoma cruzi Apesar de todos os T. cruzi parecerem iguais...

12 Trypanossoma cruzi Eles possuem algumas diferenças entre si. E são nessas diferenças que nós estamos interessados.

13 Variabilidade do parasita
Trypanossoma cruzi Aspectos Genéticos Bioquimicos Biológicos Variabilidade do parasita A variabilidade do T. cruzi vem sendo bastante estudada ao longo desses 90 anos. E os diversos estudos mostraram um grande variabilidade dos parasitas que fazem parte da espécie T. cruzi. Já foram relatadas variações entre os parasitas tanto em aspectos biológicos, como forma da célula, velocidade de crescimento, infectividade em animais experimentais, quanto em aspectos bioquímicos, como diferenças nos perfis de isoenzimas e mais recentemente em aspectos genéticos, sendo que até o número de cromossomos pode variar entre as diferentes cepas e clones de T. cruzi. Após os resultados destes diversos estudos terem sido analisados em conjunto, em

14 Durante a conferência internacional comemorativa dos 90 anos da descoberta da doença de Chagas realizada no Rio de Janeiro, foi proposta uma nova nomenclatura para o grupo T. cruzi.

15 Trypanossoma cruzi Nova nomenclatura (1999) Ciclo Silvestre
Adaptado a marsupiais T. cruzi I Baixa parasitemia Pacientes assintomáticos T. cruzi Apesar da grande variabilidade observada por diferentes metodologias, era possível agrupar as cepas e clones de T. cruzi em dois grandes grupos que foram denominados T. cruzi I e T. cruzi II. As cepas pertencentes ao grupo T. cruzi I geralmente estão associadas ao ciclo silvestre da doença de Chagas, tendo sido encontradas adaptadas a marsupiais. Quando infectam o homem, os pacientes apresentam baixa parasitemia e geralmente são assintomáticos. As cepas do grupo II estão associadas ao ciclo doméstico da doença de Chagas e quando encontradas no ciclo silvestre estão mais adaptadas a primatas. Os pacientes geralmente apresentam alta parasitemia e diferentes formas crônicas da doença. Apesar desta nomenclatura ser apenas de efeito didático, esta variabilidade pode ser refletida na clínica da doença. O que acontece é que geralmente que um paciente está infectado não com apenas um tipo de parasita, mas com uma população de diferentes clones, que nós chamamos cepa multiclonal. Ciclo doméstico Adaptado a primatas T. cruzi II Alta parasitemia Pacientes crônicos

16 Infecções policlonais de T. cruzi
Trypanossoma cruzi Infecções policlonais de T. cruzi Ciclo silvestre Ciclo doméstico É fácil supor que um mesmo barbeiro irá picar diferentes animais ou pessoas, sendo assim, os parasitas presentes em seu tubo digestivo terão origens diferentes e, nas suas fezes, estará presente não apenas um tipo de parasita, mas uma mistura deles. Da mesma forma, um mesmo animal ou pessoa, vivendo em um local infestado de barbeiros, poderá ser picado por diferentes vetores, carregando diferentes populações de parasitas. Isso acarretaria uma infecção policlonal, ou seja, por uma mistura de diferentes parasitas. Esta constatação de que pessoas diferentes estão infectadas por populações de parasitas diferentes nos leva a uma pergunta:

17 Diferentes formas clínicas
Diferentes parasitas Diferentes formas clínicas Será que as diferentes formas clínicas ocorrem porque os pacientes estão infectados com parasitas diferentes? E será que nós seremos capazes de fazer uma correlação do tipo: parasitas do tipo X causam a forma cardíaca, parasitas do tipo Y causam forma digestiva e assim por diante? Muitos pesquisadores têm tentado responder a estas perguntas, mas por enquanto ninguém ainda obteve sucesso.

18 Estudos Moleculares Caracterizar geneticamente os parasitas
Nós também estamos tentando responder a estas perguntas do ponto de vista molecular. Um dos objetivos do nosso grupo de pesquisa é o de caracterizar geneticamente os parasitas da espécie T. cruzi e tentar correlacionar as diferenças genéticas entre eles com as diferentes formas clínicas da doença que eles causam. Para isso, nós escolhemos um marcador molecular que fosse sensível o bastante para detectar diferenças sutis entre os parasitas. Os marcadores escolhidos foram os microssatélites de DNA. Correlacionar com formas clínicas da doença de Chagas

19 Microssatélites de DNA
Como a Andréia já explicou brilhantemente, os microssatélites são seqüências de DNA contendo repetições de motivos simples, como di, tri e tetra nucleotídeos, que estão espalhados no genoma dos eucariotos. O T. cruzi é um eucarioto...

20 Locos de microssatélites em T. cruzi
Repetição MCLE01 (CA) 9 MCLE08 2 AA(CA) 12 SCLE10 (GT) (TG) 10 SCLE11 (AC) MCLF10 A (CA) 14 MCLG10 8 MCLE03 (CT) 4 CTAT(GT) 15 MCLE05 (TC) AAT (AAT) TAC (TAC) TAT (TAT) 20 AAAT (AAAT) 6 e também possui microssatélites de DNA. O que significa que podemos fazer teste de paternidade em T. cruzi... Aqui estão representados 8 locos de microssatélites de T. cruzi e o tipo de repetição que eles apresentam. Bem, mas o importante é saber que os mesmos locos de microssatélites, em parasitas diferentes, possuem diferentes números de repetições. E nós podemos detectar estas variações...

21 Amplificação de microssatélites (PCR)
alelo A alelo B alelo C AA AB AC BB BC CC Através da PCR. Amplificando o DNA das diferentes cepas de T. cruzi, utilizando iniciadores flourescentes que flanqueiam a repetição, nós obteremos em um gel de acrilamida, fragmentos de DNA de tamanhos diferentes.

22 Análise dos fragmentos
ALF Ao analisarmos estes fragmentos no sequenciador automático de DNA os fragmentos aparecerão como picos que indicam o tamanho exato do fragmento em pares de bases. Os tamanhos diferentes dos picos indicam diferentes números de repetições. Uma vez que o T. cruzi é uma espécie predominantemente diplóide, a mesma cepa pode ter 2 alelos de diferentes tamanhos LASER

23 Perfis dos fragmentos amplificados
B C D A - Monoclonal (homozigoto) B - Monoclonal (heterozigoto) C - Policlonal Se ao analisar uma cepa de T. cruzi encontramos apenas um pico, dizemos que esta cepa é monoclonal (ou seja formada de um só clone, todos os parasitas da população são iguais) e homozigota (tem os dois alelos com o mesmo tamanho). Se encontramos dois picos, dizemos que esta cepa é também monoclonal, mas heterozigota (ou seja, com dois alelos com número de repetições diferentes). Agora, se encontramos 3 ou mais picos, consideramos esta cepa uma cepa policlonal, ou seja, formada de clones diferentes. Nós temos utilizado este mesmo tipo de análise para 3 abordagens diferentes: D - Policlonal

24 Análises filogenéticas Tecidos de pacientes chagásicos Microssatélites
Para fazer uma análise filogenética das cepas de T. cruzi, ou seja, verificar quais são mais parecidas entre si e quais são mais diferentes. E verificar quais são policlonais e quais são monoclonais. Para estudar cada uma das células de T. cruzi provenientes de uma mistura de clones diferentes. E para verificar se os diferentes tecidos de um paciente infectado apresentam diferentes tipos de T. cruzi. A primeira abordagem que eu vou apresentar aqui é a abordagem filogenética. Nós analisamos estes locos de microssatélites em um grande número de cepas de T. cruzi que estão disponíveis, congeladas nos banco de cepas do laboratório de biologia de T. cruzi da UFMG, coordenado pelo professor Egler Chiari, além de cepas doadas por outros grupos do Rio de Janeiro, São Paulo e Paris. Células únicas de T. cruzi

25 A D B C Análises Filogenéticas A B Tamanho dos alelos C D PCR
0  semelhança 1  diferença O DNA extraído dos parasitas foi amplificado por PCR e os tamanhos dos alelos determinados através do sequenciador automático de DNA. As cepas policlonais foram excluídas da análise uma vez que era impossivel determinar quais tamanhos de alelos correspondiam a cada um dos clones que formam a cepa policlonal. O tamanho dos alelos das cepas monoclonais foram então dispostos em uma tabela e um programa de computador transformou estes dados em uma matriz de 0s e 1s onde o 0 indica semelhança entre duas cepas e o 1 indica diferença entre elas. Esta matriz foi utilizada então para a construção de uma árvore filogenética onde, as cepas mais semelhantes (como por exemplo A e D) estão agrupadas de maneira mais próxima que cepas com maior número de diferenças entre elas, como por exemplo as cepas A e C. A D B C Árvore filogenética MATRIZ

26 Trypanossoma cruzi Árvore filogenética T. cruzi I T. cruzi II Rb IX
Rb VI 1502 D7 GLT 600 1523 Rb I 84Ti 95/94 1931 GLT 564 Esta é a árvore, obtida através da análise de 8 locos de microssatélites em 20 cepas de T. cruzi. Vocês podem notar que nenhuma cepa foi idêntica a outra, cada cepa apresentou um perfil único, como uma impressão digital de DNA. Isso nos indica que a análise de microssatélites é uma metodologia poderosa capaz de detectar pequenas diferenças mesmo entre cepas bem parecidas, como estas duas por exemplo Ig 62 e Ig 539. Todas as cepas analisadas aqui já haviam sido estudadas por outros métodos e de acordo com suas características elas foram classificadas como pertencentes ao grupo T. cruzi I, em azul ou ao grupo T. cruzi II, em vermelho. Como vocês podem ver, é clara a separação entre dois grupos de cepas, correspondendo exatamente às cepas dos grupos T. cruzi I e T. cruzi II. Isto nos mostra que as análises de microssatélites, apesar de conseguirem diferenciar quaisquer duas cepas também refletem as semelhanças entre elas e que estas semelhanças e diferenças estão em concordância com as observadas por outras técnicas que analisam aspectos biológicos, bioquímicos ou outras partes do genoma do parasita. GLT 593 200pm 803 Ig 62 103894 Ig 539 T. cruzi I 11/94 T. cruzi II 27/94 58/94

27 Análises filogenéticas Tecidos de pacientes chagásicos
Microssatélites A segunda abordagem que eu vou apresentar para vocês é a análise de células únicas de T. cruzi. Esta técnica ainda está sendo desenvolvida pelo nosso laboratório e o objetivo principal dela é nos permitir pegar uma cepa policlonal qualquer, separar cada célula única que a compõe e caracterizá-la quanto aos seus microssatélites. Isto nos permitirá conhecer com certeza quantos e quais clones formam uma determinada cepa. Células únicas de T. cruzi

28 PCR de células únicas Epimas tigotas de T. cruzi
Separação das células únicas através do FACS Fluorescence Activated Cell Sorter Epimas tigotas de T. cruzi Para desenvolver esta técnica, por enquanto a gente vem trabalhando com misturas artificiais de clones. Nós utilizamos inicialmente uma cultura de formas epimastigotas de dois ou mais clones conhecidos. Fazemos misturas artificiais contendo a mesma quantidade de células cada um dos clones. (aperta) E separamos utilizando um aparelho chamado FACS ou Fluorescent Activated Cell Sorter. Quando submetemos células epimastigotas de T. cruzi ao FACS, o aparelho detecta a autofluorescência que as células emitem e as indica no computador como pontos em um gráfico de flourescência versos tamanho da célula. Neste gráfico podemos ver o perfil gerado pelas células de uma cepa de T. cruzi. Nós selecionamos a área que contém o tamanho de célula e intensidade de fluorescência que nos interessa e falamos para o aparelho que, toda vez que uma célula com estas características passar pelo seu detector laser, ele deve separá-la em um tubo ou placa que nós acoplamos ao aparelho. Funciona da seguinte forma (aperta) O aparelho suga a suspensão contendo a mistura de células que nós preparamos e as despeja por um caninho fininho. No início deste caninho tem um dispositivo chamado nozzle que vibra de maneira constante, o que faz com que o líquido forme gotas de tamanho tal que possam conter apenas uma célula. Quando uma gota, contendo uma célula de interesse, passa por um laser que detecta sua fluorescência, um sinal é enviado ao computador que manda uma descarga elétrica fazendo com que esta gota se torne carregada. Quando a gota sai pelo cano, ela passa por entre duas placas eletricamente carregadas. Se a gota estiver carregada positivamente, será atraída pela placa carregada negativamente e será desviada para a esquerda, por exemplo, caindo no tubinho da esquerda. Se estiver carregada negativamente cairá no tubinho da diretita. Se a gota não estiver carregada, cai no meio, no tubinho lixo. Desta forma podemos separar, por exemplo, duas populações celulares com fluorescências diferentes. Mas no nosso caso, nós substituímos os tubinhos por uma placa de 96 wells e programamos o aparelho para depositar uma única célula de interesse em cada well.

29 PCR de células únicas PCR microssatélites Epimas tigotas de T. cruzi
Fluorescence Activated Cell Sorter Microplacas de 96 wells Epimas tigotas de T. cruzi Separação das células únicas através do FACS PCR microssatélites O aparelho então coloca uma célula de T. cruzi em cada well que já contém um tampão de lise, nós submetemos a plaquinha ao calor pra que as células arrebentem liberando o DNA, colocamos o mix de PCR contendo DNTP, os iniciadores, tampão e a enzima taq DNA polimerase e fazemos a PCR de microssatélites diretamente na plaquinha. Após a amplificação das células, nós verificamos o produto de amplificação através de eletroforese em gel e estabelecemos o tamanho dos alelos através do sequenciador automático de DNA. Sequenciador automático de DNA Eletroforese

30 Sequenciador automático
PCR de células únicas Eletroforese Sequenciador automático 1 célula DNA JG DNA Colombiana PM Controle - 1 - Well contendo 1 célula 2 - Well contendo 1 célula 3 - DNA de JG 4 - DNA de Colombiana Este slide mostra um dos primeiros resultados que nós obtivemos. Neste experimento nós misturamos quantidades iguais de células de T. cruzi pertencentes as cepas monoclonais JG e Colombiana. Nós submetemos esta mistura ao aparelho e, após a PCR nós pudemos verificar, em um gel de poliacrilamida corado pela prata, a presença de dois perfis diferentes correspondendo à amplificação do DNA da cepa JG ou da cepa colombiana. Nas canaletas 1 a 3, vemos os produtos da amplificação a partir de wells contendo apenas 1 célula. Na canaleta 4 o perfil da amplificação do DNA extraído da cepa JG e de colombiana na canaleta 5, para efeito de comparação. Podemos perceber que os 2 primeiros wells apresentam claramente o perfil correspondente ao da cepa JG, enquanto que o outro well apresentou um perfil semelhante ao da cepa colombiana. Quando corremos estes produtos no sequenciador automático de DNA, podemos confirmar isso. Na linha 1, está o produto obtido do well 1, que apresenta um só pico de 190 pares de bases. Na linha 2 a amplificação do well 3 do gel contendo o perfil de colombiana com um pico de 180 pares de bases. E na canaleta 4 o DNA extraído de JG com um pico de 190pb e na linha 5 o DNA de colombiana, apresentando o pico de 180pb. Como vocês podem ver esta metodologia foi capaz de detectar células pertencentes aos 2 diferentes clones que estavam presentes na mistura inicial, indicando que podemos utilizar esta metodologia para identificar os diversos clones que formam uma cepa naturalmente policlonal.

31 Análises filogenéticas Tecidos de pacientes chagásicos
Microssatélites A última abordagem dos estudos de microssatélites que eu vou apresentar para vocês é a análise de microssatélites diretamente em tecidos de pacientes chagásicos. O nosso objetivo é desenvolver uma metodologia capaz de nos dizer se o parasita responsável pela infecção no coração de um paciente, por exemplo, é o mesmo que está presente no sangue ou no reto. Células únicas de T. cruzi

32 Modelo Histotrópico Clonal
Trypanossoma cruzi Modelo Histotrópico Clonal Parasitas disponíveis para análise Infecção policlonal REDUÇÃO POPULACIONAL Quando um barbeiro infectado com uma mistura de cepas de T. cruzi entra em contato com o homem, nem todos os parasitas que ele transmite são capazes de estabelecer a infecção em um hospedeiro vertebrado. Os clones que conseguem se estabelecer, provavelmente competem entre si e colonizam tecidos diferentes deste paciente. O isolamento de uma cepa de um paciente geralmente é feito através do sangue e pode ser que as cepas presentes no sangue deste paciente não sejam as mesmas que estão infectando os tecidos. E posteriormente, o cultivo e a manutenção destas cepas em laboratório pode selecionar clones mais adaptados aos meios de cultura. Este tipo de cenário, foi chamado pelo nosso grupo de modelo histotrópico clonal da doença de Chagas e resulta em uma redução populacional em três pontos, fazendo com que os parasitas disponíveis para a análise provavelmente não sejam os mesmos que estão infectando os diversos tecidos e muito menos os responsáveis pela infecção inicial. Não é de se admirar então que até hoje ninguém tenha achado uma correlação entre o parasita extraído do paciente e a forma clínica da doença que ele apresenta. O ideal seria, então, utilizar uma técnica que fosse capaz de estudar o parasita diretamente no tecido do paciente, evitando-se assim as etapas de redução populacional. Porém, o problema é que, na fase crônica da doença de Chagas, há uma baixa parasitemia, ou seja, é difícil encontrar o parasita nos tecidos do paciente. Seria necessária então uma técnica muito sensível, capaz de detectar um número muito pequeno de parasitas. A análise de microssatélites já se mostrou uma técnica bastante sensível, uma vez que somos capazes de amplificar o DNA de uma única célula, como eu mostrei anteriormente. Isso é possível através do uso de uma reação de PCR especial, denominada full nested PCR. Manutenção de parasitas in vitro Nem todos os clones são capazes de estabelecer infecção Isolamento

33 Full-nested PCR 5’ 3’ DNA molde inicial 1a amplificação
ATAATAATAATAATAATA 5’ 3’ TATTATTATTATTATTAT DNA molde inicial TAT externo F TAT externo R TAT int. F TAT int. R 1a amplificação 2a amplificação Produto final No Full nested PCR são realizadas duas etapas de amplificação do DNA. Na primeira amplificação, nós utilizamos um par de iniciadores flanqueando a região de repetição do microssatélite. O produto desta amplificação é usado então como DNA molde para uma segunda etapa de amplificação, utilizando iniciadores também flanqueando a repetição mas desta vez dirigidos a sítios de anelamento localizados em uma posição mais interna que os do primeiro par de iniciadores. Esta técnica nos permite aumentar muito a sensibilidade da reação, uma vez que na segunda amplificação a quantidade de DNA molde contendo nossa seqüência especifica de interesse é bastante enriquecida. Este gel...

34 Resultado Full-nested PCR
1a amplificação 2a amplificação Full nested Mostra a amplificação de diluições seriadas de DNA de T. cruzi. Na canaleta um está o peso molecular. Das canaletas 2 a 7 estão representadas as amplificações, utilizando apenas os iniciadores mais externos, da primeira amplificação em de quantidades decrescentes de DNA de T. cruzi: 100pg, 10pg, 1 pg, 100 fg e 10 fg de DNA. Na canaleta 8 está um controle positivo com 3 ng de DNA e na canaleta 9 o controle negativo da reação, sem DNA. Podemos ver que não há presença de produto detectável mesmo utilizando uma quantidade relativamente grande de DNA, como 100pg. Das canaletas 10 a 17, as mesmas diluições e controles agora utilizando apenas os iniciadores mais internos, da segunda amplificação. Podemos notar a amplificação de produtos nas canletas contendo 100pg e 10 pg de DNA, mas a baixo disso já não detectamos amplificação. Agora, nas canaletas de 18 a 24, onde foi utilizada a PCR full nested, ou seja a associação das duas amplificações, podemos verificar uma grande quantidade de produto mesmo quando partimos de uma diluição contendo apenas 10fg de DNA. Para efeito de comparação, uma célula humana contém aproximadamente 3 ug de DNA e uma célula de T. cruzi possui aproximadamente 200fg de DNA. Isso nos mostra que a PCR full nested de microssatélites é capaz de amplificar quase 5X menos DNA que o conteúdo de uma só célula de T. cruzi. Com uma metodologia tão sensível, nós partimos então para a análise de tecidos de animais artificialmente infectados. 10 fg DNA Loco TAT 1 célula humana - 3g DNA 1 célula de T. cruzi - 200fg DNA

35 Infecções experimentais
(50 tripomastigotas) (50 tripomastigotas) Col1.7G2 JG (50+50 tripomastigotas) Col+JG Para isto nós infectamos três grupos de camundongos com T. cruzi. O primeiro grupo foi infectado com apenas parasitas do clone da cepa colombiana Col1.7G2. O segundo grupo de animais foi infectado com a cepa monoclonal JG. E um terceiro grupo foi infectado com uma mistura equimolar das duas cepas. Após seis meses de infecção, que corresponderiam à fase crônica da doença, os camundongos foram sacrificados e o seu coração e reto foram retirados para análise. Os tecidos foram submetidos à lise alcalina, diluídos e uma alíquota desta diluição foi submetida à PCR full nested de microssatélites. 6m 6m 6m Reto Coração Reto Coração Reto Coração

36 Amplificação de microssatélites em tecidos de camundongos infectados
Este gel de poliacrilamida corado pela prata mostra a amplificação do loco de microssatélite AAAT, através da metodologia de full nested PCR em tecidos de um camundongo infectado com a mistura de cepas JG e colombiana. Na canaleta 1 temos o peso molecular, na canaleta 2 a amplificação do tecido do coração de um camundongo não infectado e na canaleta 3 o reto deste mesmo camundongo, são controles negativos. Na canaleta 4 a amplificação do coração de um camundongo infectado com a mistura e na canaleta 5 o reto deste mesmo camundongo. Nas canaletas 6 e 7, a amplificação dos DNAs extraídos das cepas JG e colombiana respectivamente que são nossos controles positivos. E na canaleta 10 o controle negativo sem DNA. Podemos observar que os camundongos negativos não apresentam produto de amplificação, mostrando como a reação de PCR é específica para a presença de DNA de T. cruzi. Se compararmos os perfis de amplificação dos tecidos com os dos DNAs extraídos, veremos que o perfil do coração do camundongo é muito mais parecido com o perfil da cepa JG enquanto que o perfil do reto é mais parecido com o perfil da cepa colombiana. Este resultado indica que as duas cepas estão se distribuindo de maneira diferencida pelos tecidos do animal, sugerindo uma preferência da cepa JG pelo coração e da cepa colombiana pelo reto, confirmando nossas suspeitas de que as cepas de T. cruzi se distribuem diferentemente pelos tecidos. Nós ainda estamos continuando estas análises , infectandou outros camundongos com outros clones diferentes para tentar entender melhor este processo. Nós analisamos também...

37 Tecidos de pacientes (1:10)
Amplificação de microssatélites em tecidos de pacientes Resultados Tecidos de pacientes (1:10) DNA hum. tecidos de alguns pacientes chagásicos que estavam disponíveis para estudo. Estes tecidos são fragmentos de esôfagos de pacientes portadores de megaesôfago submetidos à cirurgia corretiva no hospital escola da faculdade de medicina do triângulo mineiro de Uberaba, MG gentilmente cedidos pela Prof. Eliane Lajes. Este é um gel de poliacrilamida 6%, corado pela prata mostrando os produtos da amplificação do loco TAT a partir de fragmentos de esôfago de pacientes infectados com T. cruzi utilizando a metodologia de full nested PCR. Na canaleta 1 está o peso molecular, na canaleta 2 a amplificação de um tecido humano não chagásico, utilizado como controle negativo, as canaletas 3 a 9 mostrama amplificação do DNA de pacientes chagásicos portadores de megaesôfago e na canaleta 10 o controle negativo da reação sem DNA. Podemos verificar a presença de uma boa quantidade de produto de amplificação específico para o loco de microssatélite de T. cruzi, e que não é observado no tecido de paciente não chagásico. Esta metodologia nos abre a possibilidade de investigarmos agora, diferentes tecidos de um mesmo paciente portador da doença de Chagas para verificarmos a presença de diferentes parasitas causando a infecçao nos diferentes órgãos. Bom, então os resultados que eu apresentei aqui fazem parte da minha tese de doutorado que eu venho desenvolvendo no laboratório de genética e bioquímica. E nós esperamos em breve analisar podermos entender melhor o papel destes diferentes parasitas que nós temos observado nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas.

38 Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG
LGB Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG “Grupo dos Cruzi” Juliana Jorge Renato Este é o grupo dos cruzi lá do laboratório de genética e bioquímica, que é coordenado pelo Dr. Sérgio Pena. A responsável por esta linha de pesquisa no lab e a prof. Andréa Mara Macedo, minha orientadora e uma das pessoas que mais entendem de biologia molecular de parasitas no Brasil. Este é o Renato, estudante de mestrado que desenvolve um projeto de estudo da variabilidade de T. cruzi no inseto vetor. E estes dois, Jorge e Simone, são estudantes de iniciação científica que nos ajudam nos nossos projetos e desenvolvem também seus proprios projetinhos. Muito obrigada.... Simone Prof. Andréa Macedo