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O Papel da Genética do Parasita na Doença de Chagas Juliana Ramos Pimenta Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG.

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1 O Papel da Genética do Parasita na Doença de Chagas Juliana Ramos Pimenta Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG

2

3 Prevalência: 16 a 18 milhões de infectados (WHO, 1991) Formas de transmissão: Transmissão vetorial Transmissão transfusional Transmissão congênita Formas excepcionais de transmissão Distribuição Doença de Chagas

4

5 Fase Aguda alta parasitemia alto parasitismo tissular edema periorbital (1-2%) sintomas leves miocardites/encefalites agudas Doença de Chagas

6 Fase Crônica baixa parasitemia baixo parasitismo tissular nenhum sinal aparente diferentes formas Cardíaca Digestiva Indeterminada ? Cardio-digestiva Doença de Chagas

7 Trypanosoma cruzi

8 Formas do parasita TripomastigotaAmastigotaEpimastigota 1.5 a 5 10 a 20 Trypanosoma cruzi

9

10 Isolado de um paciente Cepas X Clones CEPA (MC43) MC43- Clone1 MC43- Clone2 MC43- Clone3 MC43

11 Trypanossoma cruzi

12

13 Aspectos Genéticos Aspectos Bioquimicos Aspectos Biológicos Variabilidade do parasita Trypanossoma cruzi

14

15 T. cruzi T. cruzi I T. cruzi II Nova nomenclatura (1999) Pacientes assintomáticos Adaptado a marsupiais Ciclo Silvestre Baixa parasitemia Alta parasitemia Pacientes crônicos Ciclo doméstico Adaptado a primatas Trypanossoma cruzi

16 Ciclo silvestre Ciclo doméstico Infecções policlonais de T. cruzi Trypanossoma cruzi

17 Diferentes parasitas Diferentes formas clínicas

18 Estudos Moleculares Correlacionar com formas clínicas da doença de Chagas Caracterizar geneticamente os parasitas

19 Microssatélites de DNA

20 Locos de microssatélites em T. cruzi LocoRepetição MCLE01 (CA) 9 MCLE08 (CA) 2 AA(CA) 12 SCLE10 (GT) 2 (TG) 10 SCLE11 (AC) 9 MCLF10 (CA) 2 A (CA) 14 MCLG10 (CA) 8 MCLE03 (CT) 4 (GT) 2 CTAT(GT) 15 MCLE05 (TC) 9 (GT) 4 AAT (AAT) 8 TAC (TAC) 15 TAT (TAT) 20 AAAT (AAAT) 6

21 AA ABACBBBCCC Amplificação de microssatélites (PCR) alelo A alelo B alelo C

22 ALF LASER Análise dos fragmentos

23 A B CD A - Monoclonal (homozigoto) B - Monoclonal (heterozigoto) C - Policlonal D - Policlonal Perfis dos fragmentos amplificados

24 Microssatélites Análises filogenéticas Tecidos de pacientes chagásicos Células únicas de T. cruzi

25 Análises Filogenéticas A B C D 0 semelhança 1 diferença MATRIZ Tamanho dos alelos ADBC Árvore filogenética PCR

26 95/94 200pm /94 58/94 27/94 Ig 539 Ig GLT 593 GLT Ti D7 Rb IX Rb VI GLT 600 Rb I T. cruzi I T. cruzi II Trypanossoma cruzi Árvore filogenética

27 Microssatélites Análises filogenéticas Tecidos de pacientes chagásicos Células únicas de T. cruzi

28 Epimas tigotas de T. cruzi PCR de células únicas Separação das células únicas através do FACS Fluorescence Activated Cell Sorter

29 Separação das células únicas através do FACS Microplacas de 96 wells Epimas tigotas de T. cruzi PCR de células únicas PCR microssatélites Eletroforese Sequenciador automático de DNA Fluorescence Activated Cell Sorter

30 1 - Well contendo 1 célula 2 - Well contendo 1 célula 3 - DNA de JG 4 - DNA de Colombiana PCR de células únicas 1 célulaDNA JG DNA Colombiana 1 célula PMControle - Eletroforese Sequenciador automático

31 Microssatélites Análises filogenéticas Tecidos de pacientes chagásicos Células únicas de T. cruzi

32 Modelo Histotrópico Clonal Infecção policlonal Manutenção de parasitas in vitro Parasitas disponíveis para análise Nem todos os clones são capazes de estabelecer infecção Isolamento REDUÇÃO POPULACIONAL Trypanossoma cruzi

33 ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 DNA molde inicial TAT externo F ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 TAT externo R ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 TAT int. F TAT int. R ATAATAATAATAATAATA 53 TATTATTATTATTATTAT 53 1 a amplificação 2 a amplificação Produto final Full-nested PCR

34 1a amplificação2a amplificaçãoFull nested 10 fg DNA Loco TAT 1 célula humana - 3 g DNA 1 célula de T. cruzi - 200fg DNA Resultado Full-nested PCR

35 6m Col+JG (50+50 tripomastigotas) Col1.7G2 (50 tripomastigotas) JG (50 tripomastigotas) RetoCoração RetoCoração RetoCoração Infecções experimentais

36 Amplificação de microssatélites em tecidos de camundongos infectados

37 Amplificação de microssatélites em tecidos de pacientes Resultados DNA hum. Tecidos de pacientes (1:10)

38 Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG Grupo dos Cruzi Jorge Simone Renato Prof. Andréa Macedo Juliana


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