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PROGRAMA MITOGÊNICO DESENCADEADO DURANTE A INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍCIA Laboratório de Vírus Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências.

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1 PROGRAMA MITOGÊNICO DESENCADEADO DURANTE A INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍCIA Laboratório de Vírus Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais Grupo de Transdução de Sinal Orientador: Cláudio Antônio Bonjardim Linha de Pesquisa

2 INTRODUÇÃO

3 Vírus Agentes infecciosos Constituídos basicamente de uma cápsula protéica que guarda o material genético – RNA ou DNA. Parasitas intracelulares obrigatórios Extremamente dependentes de toda maquinaria energética e biossintética de seus hospedeiros

4 Interação Vírus-hospedeiro Hospedeiro susceptível Interações altamente especializadas Tropismo da infecção

5 Interação Vírus-hospedeiro Manipulação das respostas e funções celulares do hospedeiro: Evasão da resposta imune Interferência na produção de citocinas Controle da repressão/indução da apoptose Controle da proliferação e/ou diferenciação celular Criação um ambiente celular propício para uma multiplicação bem-sucedida Manipular e intervir nas vias de sinalização que regulam esses processos

6 Alterações nas vias de sinalização celular e transcrição gênica do hospedeiro Citoplasma Núcleo

7 MAPK

8 MAPKs (Mitogen-activated protein kinase) Proliferação Apoptose Diferenciação Sobrevivência

9 MEKKs MKK7 MKK4 MKK3 MKK6 JNK/ SAPK p38 MAPKKK MAPKK MAPK Cascata de Sinalização das MAPKs Resposta Biológica Estímulo Estresse, Fatores de Crescimento, GPCRs, Citocinas Inflamatórias Raf ERK MEK Fatores de Crescimento, Mitógenos, GPCRs Crescimento, Diferenciação, Desenvolvimento Inflamação, Apoptose, Crescimento, Diferenciação

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13 Os Vírus e as MAPKs Hepatite B (HBx) HIV Herpes Influenza Hepatite C Vírus Vaccinia

14 Vírus Vaccínia Pertencente à mesma família do vírus causador da varíola Utilizado para imunização contra a varíola (1967 – 1977) Atualmente – vírus de laboratório Década de 80 – grande interesse pelo VV como ferramenta de estudos em biologia molecular Recentemente, verificou-se a emergência de zoonoses causadas pelo vírus vaccínia-like. Erradicação da doença no mundo

15 Vírus Vaccínia Família: Poxviridae Subfamília: Chordopoxvirinae Gênero: Orthopoxvirus Características: Complexos vírus envelopados que medem em torno de 300 nm; Genoma – DNA fita dupla linear; Ciclo replicativo citoplasmático. 2 tipos de partículas infectivas: - IMV: 90% da progênie viral - EEV: principais formas de disseminação do VV

16 Genoma do Vírus Vaccínia Genes Conservados ITRs 191 Kpb / 263 genes Genes essenciais – polipeptídeos estruturais e enzimas envolvidas no metabolismo da DNA Variáveis - Genes não- essenciais – interação com o hospedeiro e virulência

17 Núcleo Replicação do DNA Transcrição de genes tardios Desnudamento secundário Desnudamento primário Ciclo de Multiplicação Vírion IMV EEV IEV Morfogênese IMV Transcrição de genes imediatamente precoces Transcrição de genes imediatamente precoces Transcrição de genes precoces

18 Poxvírus e Mitogênese Fator de Crescimento do VV - VGF Similaridades estruturais e funcionais ao EGF e TGF- ; Liberado no sobrenadante das células infectadas; Estimula o crescimento e/ou a atividade metabólica de células não infectadas adjacentes, favorecendo a expansão da infecção; A atividade mitogênica de VGF é considerada benéfica para a replicação do VV.

19 Citoplasma Núcleo EGR-1 c - fos MEK ERK 1/2 Magalhães et al, 2001 Elk-1 MEK ERK 1/2 RSK 2 Andrade et al, 2004

20 Citoplasma Núcleo EGR-1 Andrade et al, 2004 TyK MEK ERK RSK-2 Elk-1 STK ? ? ? c-jun JNK CREB/ATF-1 ? ?

21 TESE DE DOUTORADO Significado Funcional do Gene de Resposta Precoce ao Crescimento – EGR-1 – para a Biologia do Orthopoxvirus Vaccinia Patrícia Nogueira da Gama Silva

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24 EGR-1 Rho Rac Cdc42 Ras PAK-1 Raf MEK ERK ? Citoplasma Núcleo Rac PAK-1 JNK MKK4/7 ?

25 ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA QUINASE - PAK1 - DURANTE A INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍNIA Luciana Garcia Andrade Projeto de Pesquisa

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27 GDP PAK-1 PAK-1 (p21-activated kinase - 1) GTP Rac / Cdc42 Serina-treonina kinase Dinâmica do Citoesqueleto / Motilidade Celular Proliferação/Sobrevivência (MEK/ERK) Pro-inflamatórios/Estresse (JNK/SAPK)

28 PAK-1 (p21-activated kinase - 1) Domínio Catalítico (aa 255 – 529) PDBAI NckGrb2 Rac Cdc42 G Domínio Autoinibitório

29 OBJETIVOS

30 Geral Analisar a contribuição da serina/treonina quinase PAK1 (p21- activated kinase) na transmissão dos sinais mitogênicos desencadeados após a infecção de células de fibroblasto murino A31 pelo vírus vaccínia.

31 Específicos Gerar clones expressando de maneira estável mutação que confere dominância negativa para a proteína PAK-1; Verificar se a infecção pelo VV induz a fosforilação de PAK- 1, bem como sua cinética de ativação; Verificar o significado funcional de PAK-1 na multiplicação do vírus vaccínia.

32 Materiais e Métodos

33 Células: Células A31 – clone de Balb/3T3 - Obtenção dos clones de PAK-1 - Infecção / Expressão protéica Células VERO - Produção do estoque do VV - Titulação viral Vírus: Vírus Vaccínia WR (Western Reserve) - Purificados /Titulados

34 Vetores: pcMV6m – WT PAK1 PAK1-WT Bam HIEco RI Amp pcMV6m – DN PAK1 PAK1- K299 R Bam HIEco RI Amp PAK – K299R Dominante Negativo para PAK-1

35 Sub-clonagem: PAK1 – WT K PAK1 – DN R pcMV6m – WT - PAK1 PAK1-WT Bam HI Eco RI Amp pcMV6m – PAK1 – K299R PAK1- K299 R Bam HIEco RI Amp

36 Transformação bacteriana: E. coli – DH5 Transformação LB Agar + AMP

37 Amplificação de cópias do plasmídio LB + AMP Purificação Pequena-escala Média-escala Eletroforese em gel de agarose Purificação do Plasmídio Transfecção de células A31

38 pcDNA 3– PAK-WT ou pcDNA 3– PAK –K299R Transfecção: Células A31 Transfecção G418 Seleção dos clones resistentes Caracterização dos clones resistentes

39 Células A31 ou Clones Carenciadas com 1% de SFB por 12 horas Infectadas com o VV (MOI de 10,0) por tempos variáveis Estratégia de Trabalho Extração de proteínas totais Western blot Extração de mRNA total Northern blot Vírus Titulação Análise de Multiplicação Viral Fenótipo de Placa de Lise Viral

40 Reação com o anticorpo primário Transferência de Western Bloqueio Reação com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase Filme Raio-X Sistema Revelador Revelação Exposição

41 Pré hibridação Hibridação com sonda marcada Revelação Lavagem + - Exposição Transferência de Northern

42 P-JNK KDa M VV M VV M VV M VV M VV A31 NT WT 6 WT 7 WT 8 WT 9 KDa P-JNK Mock VV Mock VV Mock VV Mock VV Mock VV A31 NT DN 1 DN 5 DN 6 DN 10 Teste – caracterização dos clones de PAK-1

43 Acumulação de EGR-1 induzida pelo VV

44 Co-participação de diversas vias sinalizadoras associadas com a indução de EGR-1 após infecção pelo VV

45 MEK – ERK – EGR-1

46 MEK-DN 3MEK-WT10 VV 48 hpi Controle MEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VV (Fenótipo da Placa de Lise Viral)

47 MEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VV (Análise da Multiplicação Viral)

48 O Vírus Vaccínia induz a ativação de proteínas quinases e genes envolvidos com mitogênese e/ou reprogramação celular, criando as condições necessárias à geração eficiente de novas progênies virais.


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