A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA Anderson Barbosa Hadja Radtke Mariana Uchoa Tammy Arai Florianópolis, 24 de junho de 2010.

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA Anderson Barbosa Hadja Radtke Mariana Uchoa Tammy Arai Florianópolis, 24 de junho de 2010."— Transcrição da apresentação:

1 MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA Anderson Barbosa Hadja Radtke Mariana Uchoa Tammy Arai Florianópolis, 24 de junho de 2010

2 Introdução Diversidade microbiana – bactérias, protozoários, fungos e algas unicelulares Diversidade Riqueza (n o de grupos presentes) Homogeneidade (abundância relativa de cada grupo) Maior diversidade: muitas espécies em abundância relativamente igual

3 Inventário atual da biodiversidade mundial – muito incompleto (vírus, microorganismos e invertebrados) 1,7 milhões de espécies vivas no planeta espécies identificadas de procariotos Representam apenas 1 a 10% de todas as espécies de bactérias Temos pequena idéia da nossa real diversidade microbiana

4 Solo talvez seja habitat mais explorado para isolamento de microorganismos Fontes naturais diversas oferecem ambientes ricos para exploração – água doce, matéria orgânica, sedimentos, folhas, frutos...

5 1% da população bacteriana do solo pode ser cultivada através das práticas comuns de laboratório Grande diversidade fenotípica e genética das comunidades do solo – uma das mais difíceis de estudar Análise da diversidade de um ambiente: Estudos dependentes de cultura Estudos independentes de cultura X

6 Estudos dependentes de cultura Bactérias isoladas de amostras do ambiente através de meio de cultura – ácido nucléico extraído Problema: microorganismos viáveis mas não cultiváveis (não são metabolicamente inertes: sintetizar proteínas e usar substratos)

7 São limitados - apenas bactérias que podem ser cultivadas Não refletem a real estrutura da comunidade microbiana Estudos dependentes de cultura Maioria das bactérias será excluída quando diversidade for estimada

8 Métodos independentes de cultura Extração direta dos ácidos nucléicos das amostras do ambiente – métodos moleculares produtos podem ser clonados e sequenciados: identificar e enumerar as espécies de bactérias presentes amplificação do DNA extraído por PCR e análise da diversidade das moléculas amplificadas: fingerprinting % muito maior de microorganismos, que não é cultivada em laboratório

9 Limitações dos métodos moleculares método de extração do DNA ou RNA usado: muito suave gram + não são lisadas; muito severo DNA pode ser danificado separação das células microbianas dos componentes do solo: substâncias inibitórias (ácidos húmicos) – se co-extraídas interferem na PCR Primeiros requisitos e obstáculo a ser superado: extração e purificação dos ácidos nucléicos Podem influenciar a análise e interpretação dos resultados das avaliações moleculares

10 Métodos para medir a diversidade microbiana no solo: Técnicas bioquímicasTécnicas moleculares -Contagem em placas - Nível fisiológico da comunidade (CLPP) -Microradioautografia - Atividade enzimática do solo -Analise de ácidos graxos (FAME) - Conteúdo de guanina + citosina - Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização - Microarranjos ou microchips de DNA - DGGE – TGGE - SSCP - ARDRA / RFLP - T-RFLP -RISA / ARISA

11 Contagem de placas e Níveis fisiológicos da comunidade Representa apenas microorganismos cultiváveis Favorece organismos de rápido crescimento Só representa os organismos capazes que utilizar a fonte de carbono escolhida Mostra o potencial de diversidade metabólica e não a diversidade in situ. Escolher condições de crescimento ótimas abrangentes Impossibilidade de cultivar grande quantidade de espécies Favorescimento de microorganismos com crescimento mais acelerado. Diluição da amostra Inoculação na placa Contagem dos viáveis Análise da capacidade da comunidade microbiana em utilizar determinadas fontes de carbono

12 Microradioautografia e FISH Através da quantidade absorvida por uma célula de um substrato específico marcado radioativamente, pode-se detectar e quantificar a população ativa que está usando esse substrato. FISH (Fluorescence in situ hybridization) usada para detectar a presença de uma sequência específica de DNA nos cromossomos. Usa-se um marcador fluorescente que liga-se à sequência escolhida e, através da microscopia de fluorescência pode-se visualisar a marcação. Permite elucidação da função ecológica dos microorganismos Permite elucidação da filogenética dos microorganismos

13 Atividade enzimática do solo As enzimas encontradas naturalmente no solo provém, principalmente, de microorganismos, apesar de resíduos animais e vegetais também serem uma possível fonte. Atividade enzimática Exoenzimas Endoenzimas São avaliadas as atividades de enzimas do solo associadas: - ao ciclo do carbono b-glucosidase - do fósforo fosfatase ácida - do enxofre arilsulfatase Dessa forma, pode-se associar a atividade enzimática com o papel ecológico do microorganismo presente no solo

14 Análises dos ácidos graxos Esse método informa sobre a composição da comunidade microbiana baseado em grupos de ácidos graxos. Análise por cromatografia de gás coleta saponificação metilação extração lavagem - Ácidos graxos - Ácidos graxos específicos de grupos taxonômicos Uma mudança no perfil da comunidade significa uma mudança na microbiota Perfil

15 Conteúdo guanina + citosina Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização Microarranjos de DNA Técnicas de PCR DGGE – Eletroforese em gel de gradiente desnaturante Técnicas moleculares para o estudo da diversidade microbiana

16 SSCP – Polimorfismo de conformação de fita simples RFLP/ARDRA – análise de restrição do DNA ribossomal amplificado T-RFLP – Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminais RISA - Análise de espaçador intergênico ribossomal Rep-PCR – caracterização de sequências altamente repetitivas ou microssatélites Técnicas moleculares para o estudo da diversidade microbiana

17 Diferenças na quantidade de guanina + citosina no DNA Diversidade bacteriana de comunidades do solo Diferem entre 3% e 5% Conteúdo guanina + citosina

18 Vantagens de análises G+C –Sem influência de PCR –Inclui todo o DNA extraído –Pode detectar membros raros de uma comunidade –Método quantitativo Conteúdo guanina + citosina

19 Análise de mudanças na diversidade microbiana no solo havaiano Conteúdo guanina + citosina

20 DNA total é extraído, purificado e desnaturado A taxa de hibridização ou reassociação depende da similaridade das sequências Tempo relacionado com a diversidade Importante ferramenta qualitativa e quantitativa na ecologia molecular bacteriana Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização

21 Sondas de ácidos nucleicos –Sondas são pequenas porções de DNA (ou RNA) de sequência conhecida usadas para identificar a presença de DNA complementar na amostra –A ligação das 2 fitas (sondas + amostra ) se denomina HIBRIDIZAÇÃO Hibridização pode ocorrer em suportes sólidos ou líquidos Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização

22 Desvantagens –Pouca sensibilidade –Sequências necessitam de um grande número de cópias para serem detectadas Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização

23 Microarranjos de DNA DNA microarrays Coleção de porções de DNA aderidas a suportes sólidos (vidro, plástico ou silicone) formando um conjunto que visa monitorar a expressão de múltiplos genes. Microarranjos ou microchips de DNA

24

25

26 DGGE e TGGE

27 Analise de produtos de PCR de acordo com suas sequências de pares de base* DGGE utiliza géis de poliacrilamida contendo um gradiente linear de desnaturantes ( uréia e formamida) TGGE utiliza um gradiente térmico com concentração constante de uréia e formamida DGGE e TGGE

28 Técnica rápida, relativamente barata e reproduzível DGGE e TGGE

29 Fitas simples formam estruturas secundárias que dependem do seu comprimento e da sequência de bases Detecção por autorradiografia dos produtos do PCR com marcadores radioativos ou por coloração com nitrato de prata Vantagens e desvantagens similares ao DGGE Algumas fitas podem formar mais de uma conformação SSCP

30

31 RFLP/ARDRA

32 Enzimas de restrição – fragmentos de restrição Separação por gel agarose Southern blot - Hibridização a um DNA de prova e detecção com moléculas radioativas ou fluorescentes Detecção de genótipos: MM Mm mm Útil para detectar mudanças estruturais nas comunidades bacterianas mas não para medir a diversidade ou detectar grupos específicos (Extração, PCR) RFLP/ARDRA

33 Mesmo princípio da RFLP Um primer do PCR é marcado com uma substância fluorescente Leitura do padrão de banda simplificada Uso de sequenciador automático – altamente reproduzível Possibilita a análise de comunidades complexas e a coleta de informações sobre a diversidade, mas pode trazer distorções aos resultados (escolha primer) T-RFLP

34 Região IGS entre as subunidades ribossomais 16S e 23S Heterogeneidade – útil para diferenciar estirpes bacterianas diferentes e espécies muito próximas RISA requer muito DNA, marcador de prata pode ser insensível ARISA ainda possui as limitações tradicionais do PCR RISA/ARISA

35 Sequencias de DNA repetidas de 1-10 pb - microssatélites Pode servir para diagnóstico da espécie ou linhagem Sequência deve ser conhecida para uso do primer apropriado Rep-PCR

36 Considerações finais Grande número de métodos disponíveis para estudar diversidade microbiana do solo Cada método tem suas limitações – fornece apenas um retrato parcial Aconselhável utilizar uma variedade de métodos, incorporando resultados de métodos tradicionais e moleculares


Carregar ppt "MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA Anderson Barbosa Hadja Radtke Mariana Uchoa Tammy Arai Florianópolis, 24 de junho de 2010."

Apresentações semelhantes


Anúncios Google