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Mini-Revisão Começando a decifrar... Ciclo Lítico do Fago.

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Apresentação em tema: "Mini-Revisão Começando a decifrar... Ciclo Lítico do Fago."— Transcrição da apresentação:

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2 Mini-Revisão

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4 Começando a decifrar...

5 Ciclo Lítico do Fago

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8 O fenômeno de restrição- modificação Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação. Arber, 1962 Nathans & Smith, 1962

9 Enzimas de restrição

10 Clivagem de restrição

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12 Sítio de Restrição

13 Nomenclatura das enzimas de restrição EcoRI Escherichia coli BamHIBacillus amyloliquefaciens RH BglIIBacillus globigii PvuIIProteus vulgaris HindIIIHaemophilus influenzae Rd HinfIHaemophilus influenzae Rf Sau3AStaphylococcus aureus AluIArthrobacter luteus TaqIThermus aquaticus HaeIIIHaemophilus aegyptius NotINocardia otitidis-caviarum

14 Fracionamento de DNA

15 Mapa de Restrição

16 Utilização do Mapa

17 Detectar mutações

18 Comparação de Mapas

19 Fracionamento de DNA

20 Como reconhecer o fragmento de interesse?

21 Complementariedade

22 Hibridação Calor ou pH = desnaturação

23 Reassociação Temperatura e força iônica

24 Sonda

25 Marcação da sonda Ou com Polinucleotídeo Quinase

26 Estringência Reação de Hibridação e Lavagem: especificidade da sonda tamanho da sonda temperatura (Tm) força iônica Especificidade : identidade de seqüência Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo Temperatura: Tm - 25 o C Força iônica: NaCl

27 Southern blot

28 Resultado

29 Hibridação in situ Localização de mRNA de ciclina (uma proteína que incita a célula a se dividir) = azul escuro Em azul claro os núcleos corados com DAPI

30 Hibridação in situ

31 Southern blot Animação

32 O que fazer com o fragmento? Clonagem de DNA A clonagem permite a eternizar o fragmento Um pedaço de DNA de um eucarioto poderia ser produzido por um procarioto.

33 Vetores de clonagem 1. Replicação autônoma 2. Marcas de seleção 3. Sítio para clonagem O que deve ter uma molécula para ser um veículo de clonagem?

34 Sítio de clonagem O sítio de restrição deve estar nas duas moléculas a serem ligadas. Após a clivagem, as extremidades são recombinadas e a enzima LIGASE refaz a ligação fosfodiester.

35 Plasmídio recombinante

36 Transformação Hospedeiro: E.coli fenótipo e genótipo seleção, contenção, multiplicação

37 Hospedeira transformada

38 Clonagem molecular

39 Outro vetor? Bacteriófagos e, mais recentemente, cosmídios são utilizados como vetores de clonagem, principalmente quando se deseja inserir um fragmento de DNA com tamanho de ~40 kb. YACs - fragmentos maiores ainda.

40 Biblioteca Genômica Genoteca

41 Varredura de biblioteca

42 Seqüenciamento de DNA Princípios

43 Reação em cadeia de polimerização 1. Replicação

44 PCR 2. Amplificação

45 PCR - ANIMAÇÃO Um momento, por favor, estou carregando o programa.


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