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Apoptose. Histórico 1951 – Glücksman estuda morte celular programada em embriões de mamíferos. Biol Ver 1951, 26:59-86. 1965 – Kerr descreve shrinkage.

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1 Apoptose

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3 Histórico 1951 – Glücksman estuda morte celular programada em embriões de mamíferos. Biol Ver 1951, 26: – Kerr descreve shrinkage necrosis. J Pathol Bacteriol 1965, 90: – Currie (endocrinopatologista) observa fragmentos de células no córtex da adrenal de ratos submetidos a baixas doses de 9,10-dimetil- 1,2-benzantraceno – Currie e Wyllie identificam os mesmos fragmentos celulares no córtex das adrenais de ratos recém-natos com depleção de ACTH.

4 Histórico 1971 – Kerr junta-se à Currie e Wyllie, identificam shrinkage necrosis em condições fisiológicas e patológicas. Crowford chama a atenção do do grupo para as publicações sobre estudos com embriões e morte celular programada – Kerr, Wyllie e Currie sugerem que necrose seria um termo inapropriado para descrever morte celular que ocorre em condições fisiológicas. Sugerem o termo apoptose para o contrário de mitose na regulação do tamanho dos tecidos. Br J Câncer 1972, 26: Década de 80 – estudos de biologia molecular levam a importantes avanços na compreensão da apoptose.

5 Onde ocorre ? Embriogênese Morte neuronal, desaparecimento to timo e ducto tireoglosso, atrofia prostática pós castração Involução de tecidos dependentes de hormônios Processo de reparo e inflamação aguda

6 Controle do turnover celular Neoplasia –Células malignas têm a capacidade diminuída em sofrer apoptose frente a um estímulo fisiológico Doenças auto-imunes –Perda do controle fisiológico da morte de linfócitos auto-reativos após o término da resposta imune Infecção viral –Capacidade de inibir a apoptose pela produção de proteínas supressoras da morte celular

7 Métodos de Detecção da Apoptose Microscopia de luz Microscopia eletrônica Técnica do TUNEL Técnica de ISEL Marcação in situ da cadeia terminal 3OH Quantificação por FACS Fotografia por espaço de tempo Southern blot + Hibridização

8 Morfologia Microscopia eletrônica –alterações nucleares –alterações citoplasmáticas –alterações da membrana plasmática –separação das células vizinhas –formação de corpos apoptóticos –rápida fagocitose de corpos apoptóticos pelas células vizinhas e por macrófagos

9 Morfologia Microscopia óptica –corpos apoptóticos com ou sem material nuclear basofílico –apoptose observada em condições normais corpos de Councilman (fígado) corpos cariolíticos (criptas intestinais) corpos tingíveis (macrófagos dos centros germinativos de linfonodos) corpos de Civatte (liquem plano) queimadura solar (irradiação ultravioleta, na pele) formação de pigmentos de lipofucsina (na melanosis coli) –Redução do número de células sem comprometimento da arquitetura tecidual.

10 Bioquímica fragmentação rápida e regular do DNA nuclear –300-, depois em 50-kilo pares-base –divisão da dupla-fita em DNA internucleosomal Proteinases citoplasmáticas

11 BIOLOGIA MOLECULAR

12 Ciclo Celular G1 M G2 S G0 Células Quiescentes

13 Ciclinas O progresso das células através das diferentes fases do ciclo celular é controlado por complexos de proteínas quinases (CDKs), as quais são controladas por proteínas designadas ciclinas. CDKs: cyclin depend kinases: –moléculas que possuem níveis celulares constantes –apresentam-se em formas ativas e inativas –ativadas pelas ciclinas Os níveis celulares de cada ciclina apresentam picos em fases específicas do ciclo celular –ciclina D combina-se com CDK4 e CDK6 na fase G1 –ciclina E combina-se com CDK2 no final da fase G1 –ciclina A combina-se com CDK2 e CDK1 na fase S –ciclina B combina-se com CDK1 na fase G2

14 Ciclinas As ciclinas são cofatores na ativação de proteínas específicas: –quinases dependentes da ciclinas (CDK) –fosforilam inúmeras outras proteínas –estimulam a passagem pelas diversas etapas do ciclo celular –inibidas por proteínas inibidoras das quinases: inespecíficas –p21, p27 e p57 específicas –p15, 16, 18 e 19

15 Genes Supressores Tumorais Genes que codificam proteínas capazes de alterar o ciclo celular na presença de mutações ou danos ao DNA –reparam o DNA lesado –interrompem o ciclo celular em células com danos severos induzem a apoptose –liberam o ciclo após o reparo

16 Genes Supressores Tumorais Mecanismos oncogênicos através dos genes supressores tumorais –inativação de um dos alelos por mutação herdada mutação de novo deleções ou rearranjos –Inativação do segundo alelo –Após a perda completa da expressão do gene ocorre a neoplasia

17 Regulação genética c-myc p53 mutante bcl-2

18 Mecanismo de ação da p53 Célula normal Dano no DNA Up-regulation dos genes alvo p21 inibidor das CDK GAAD 45 reparador do DNA bax (gene ativador da apoptose) Ciclo interrompido em G1 Reparo do DNAFalha no reparo P53 ativada liga-se ao DNA Células normaisApoptose

19 Apoptose consiste na morte celular programada, na qual a célula entra em um rígido processo de auto-destruição Presença de intensa condensação da cromatina com aspecto bolhoso e picnose nuclear. Freqüentemente acompanhada por degradação internucleossomal do DNA –A eletroforese apresenta um padrão escalonado (ladder) A apoptose é controlada por uma família de proteínas: bcl-2 bcl-xL Inibem a apoptose bax bad bcl-xS Desencadeiam a apoptose

20 Apoptose Família bcl-2 Família de genes que codifica proteínas homo e heterodímeros –bcl-2 e bcl-xL inibem a apoptose –bax, bad e bcl-xS induzem a apoptose pela ativação da via das caspases bcl-2 –gene inibidor da apoptose –codifica proteína localizada na membrana externa das mitocôndrias, na membrana do retículo endoplasmático rugoso e na carioteca –sua mutação foi inicialmente identificada em linfomas foliculares de células B t(14;18) (q32;q21)

21 Apoptose bcl-2 Mecanismos de ação do bcl-2 –para que ocorra a apoptose, deve haver liberação do citocromo C do interior das mitocôndrias dimerização do bax forma canal para liberação do citocromo C dimerização do bcl-2 inibe a formação de canais –p53 ativa, estimula a dimerização do bax apoptose –ação sinérgica do c-myc e do bcl-2 c-myc: estimula a proliferação bcl-2: inibe a apoptose

22 APOPTOSE NO TECIDO HEPÁTICO

23 FÍGADO Condições fisiológicas (regressão; regeneração) Doenças Tratamentos Exemplos –remoção de estimulo mitogênico (nitrato) ou de promotores tumorais (acetato de cyproterona) – Administração de 1,1 dicloroetileno, ciclohexamide, dimetilnitrosaminas, 1-ß-D- etanol

24 DISTRIBUIÇÃO Corpos apoptóticos ao redor da veia hepática terminal (ratos tratados com etanol) Sugere que a idadeda célula pode determinar qual célula irá morrer Infecção viral induzindo a formação de corpos de Councilman

25 Carcinogênese Taxa de crescimento: diferença entre replicação e morte celular Carcinógenos não genotóxicos: efeitos através da estimulação da replicação celular e modulação da incidência de apoptose

26 Após iniciação muitas células entram em apoptose e nunca se desenvolve um foco pre- neoplasico apoptose determina a eficiência da iniciação Estágio de promoção: focos pré neoplásicos exibem altas taxas de replicação celular, mas pouco crescimento, isso devido ao aumento da apoptose promotores tumorais inibem apoptose e aceleram o crescimento e carcinogênese A apoptose em nódulos neoplásicos e tumores é um importante fator determinante do crescimento e pode ser regulado por hormônios que podem diminuir ou acelerar o crescimento tumoral

27 TGF-beta 1 Iniciação da apoptose Induz a apoptose em hepatócitos isolados in vivo hepatócitos que sofreram apoptose são positivos com marcadores imunohistoquímicos (anticorpos contra precursores do TGF-beta 1)

28 Sistema fas/fas ligand Proteína de membrana plasmática (receptor de membrana) Administração de anticorpos anti-fas ou do fas ligand determina apoptose (situação semelhante a hepatite fulminante) fas está super-expressado em doenças crônicas hepáticas (HBV; HCV), o que pode explicar a apoptose na necrose saca bocada

29 Nos casos de apoptose induzidas pelo sistema fas o grupo de proteínas - caspases - estão ativadas; isso abre a porta para um possível tratamento através da inibição dessas enzimas\ Em algumas linhagens celulares de hepatomas, as células escapam da apoptose devido a anormalidades do sistema fas correlacionando com disfunção da proteína fas ou de sua cascata; adequação de terapias anti-tumorais

30 Transplante hepático Oclusão vascular precoce X disfunção primária do enxerto X rejeição Apoptose: detectada na citotoxicidade imunomediada e nos casos de isquemia moderada Células apoptóticas são encontradas freqüentemente nos órgãos com rejeição

31 Apoptose é um mecanismo de lesão tecidual precoce, antes da necrose; aumento da apoptose deve ser interpretado como um sinal precoce de isquemia indicando oclusão vascular inicial (Sediv, et al - Histopathology 1998) Apoptose de células endoteliais seguida pela dos hepatócitos é um importante envento da morte celular após injúria por isquemia/ reperfusão (Kohli V, et al - Transplantation, 1999) Inibição da apoptose através de alvos moleculares específicos pode servir para controlar a injúria por reperfusão (Kuo PC, et al - Clin Transplantation, 1998)

32 Increased apoptosis of hepatocytes in vascular occlusion after orthotopic liver trasnplantation Gollackner B, et al. Tranpl Int 2000, 13 (1): pacientes (m = 46; f = 26) (idade média 47; 1 a 64 anos) Método TUNEL Disfunção primária do enxerto (n=9) oclusão vascular (n = 11) rejeição aguda precoce (n= 22) controles (11)

33 RESULTADOS Os maiores índices de apoptose foram observados nos casos de oclusão vascular (P<0.001) Enxertos com disfunção primária evidenciaram hepatócitos 100% necróticos Rejeição aguda evidenciaram uma contagem de céls apoptóticas maior que o controle (P<0.003) que aumenta diretamente com a severidade da rejeição


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