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Cinética Enzimática Prof. Dr. Henning Ulrich.

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1 Cinética Enzimática Prof. Dr. Henning Ulrich

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5 Influência do Substrato Concentração de substrato [S]: afeta a velocidade da reação; Concentração de substrato [S]: afeta a velocidade da reação; Efeito de [S]: varia durante o curso de uma reação S P; Efeito de [S]: varia durante o curso de uma reação S P; Velocidade inicial (V 0 ): [S] >> [E] tempo muito curto [S] = constante. Velocidade inicial (V 0 ): [S] >> [E] tempo muito curto [S] = constante.

6 Influência do Substrato [E] = cte [S] = V 0 linear [S] = V 0 V 0 = V máx

7 Influência do Substrato Alguns casos a V 0 não pode ser medida Alguns casos a V 0 não pode ser medida Não existe técnica experimental;Não existe técnica experimental; Equação química não representa a transformação;Equação química não representa a transformação; Velocidade da reação: Velocidade da reação: Velocidade média de consumo ou produção; Velocidade média de consumo ou produção; Variação de uma propriedade no sistema. Variação de uma propriedade no sistema.

8 Influência do Substrato Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para formar ES passo obrigatório; Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para formar ES passo obrigatório; Leonor Michaelis e Maud Menten (1913) Leonor Michaelis e Maud Menten (1913) E combina-se reversivelmente com S ESE combina-se reversivelmente com S ES k 1 k 1 E + S ES k -1 k -1 ES se rompe E e PES se rompe E e P k 2 k 2 ES E + P

9 Influência do Substrato Qualquer instante da reação: E e ES; Qualquer instante da reação: E e ES; [S] = velocidade da reação [S]; [S] = velocidade da reação [S]; V máx = todas as moléculas de E estiverem na forma ES enzima saturada; V máx = todas as moléculas de E estiverem na forma ES enzima saturada; [S]: estado pré-estacionário ES; [S]: estado pré-estacionário ES; Estado estacionário [ES] = cte;Estado estacionário [ES] = cte; V 0 estado estacionário.V 0 estado estacionário.

10 Equação Michaelis-Menten Curva: possui a mesma forma para a maioria das enzimas; Curva: possui a mesma forma para a maioria das enzimas; Expressa pela Equação de Michaelis e Menten; Expressa pela Equação de Michaelis e Menten; Hipótese: limitante quebra de ES E + P.

11 Equação Michaelis-Menten Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato; Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato; Relação quantitativa entre a V 0, a V máx e a [S] inicial relacionadas através de K m. Relação quantitativa entre a V 0, a V máx e a [S] inicial relacionadas através de K m.

12 Equação Michaelis-Menten Relação numérica: V 0 é metade de V máx ; Relação numérica: V 0 é metade de V máx ; k m = afinidade pelo substrato; k m = afinidade pelo substrato; K m afinidade K m afinidade V máx é proporcional à [E].

13 Significado de K m e V máx Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica; Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica; Mecanismos de reação diferentes catalisam reações com 6 ou 8 passos; Mecanismos de reação diferentes catalisam reações com 6 ou 8 passos; Significado e magnitude de V máx e K m varia; Significado e magnitude de V máx e K m varia; K m : depende de aspectos específicos do mecanismo de reação. K m : depende de aspectos específicos do mecanismo de reação.

14 Significado de K m e V máx K 2 << K -1 afinidade da enzima; K 2 << K -1 afinidade da enzima; K 2 >> K -1 ; K 2 >> K -1 ; K 2 e K -1 são comparáveis a K m função complexa; K 2 e K -1 são comparáveis a K m função complexa; V máx : número de passos da reação e identidade dos passos limitantes. V máx : número de passos da reação e identidade dos passos limitantes.

15 Significado de K m e V máx Enzima na saturação: EP e V máx = k 3.[Et]; Enzima na saturação: EP e V máx = k 3.[Et]; K cat = velocidade limitante de qualquer reação enzimas saturadas; K cat = velocidade limitante de qualquer reação enzimas saturadas; K cat e K m = ambiente celular, concentração do substrato e química da reação. K cat e K m = ambiente celular, concentração do substrato e química da reação. E + S ES EP E + P K 1 K 2 K 3 K -1 K -2

16 Complexo enzima-substrato: ES v (formação) = k 1 [S] [E] { v (degradação) = k -1 [ES] + k 2 [ES] = (k -1 + k 2 ) [ES] Estado estacionário (steady state): [ES] = constante v de formação = v de degradação ou: k 1 [S] [E] = (k -1 + k 2 ) [ES] [S] [E] / [ES] = (k -1 + k 2 ) / k 1 { (k -1 + k 2 ) / k 1 = K m Constante de Michaelis [ES] = [S] [E] / K m { [E] = [E T ] – [ES] { [ES] = ([E T ] – [ES]) [S] / K m [ES] = [E T ] [S] / K m – [ES] [S] / K m {[ES] + [ES] [S] / K m = [E T ] [S] / K m ([ES] K m + [ES] [S]) / K m = [E T ] [S] / K m { [ES] (Km + [S]) / Km = [ET] [S] / Km [ES] = [E T ] [S] / K m + [S]

17 [ES] = [E T ] ( [S] / K m + [S] ) [ES] = v / k 2 [E T ] = V max / k 2 v / k 2 = V max / k 2 ( [S] / K m + [S] )

18 Variável dependente: velocidade de reação, função de [S]. Constante * : velocidade máxima Variável independente: concentração do substrato. Constante de Michaelis: K D aparente de ES. * Constante: V max é função de [E] total

19 Parâmetros Cinéticos Exemplo: Exemplo: [S] (g/L) V o (g/L.h) [S] (g/L) V o (g/L.h) 0,25 0,78 0,25 0,78 0,51 1,25 0,51 1,25 1,03 1,66 1,03 1,66 2,52 2,19 2,52 2,19 4,33 2,35 4,33 2,35 7,25 2,57 7,25 2,57

20 Parâmetros Cinéticos Exemplo: Lineweaver-Burk

21 Inibidores Competitivos Forma estrutural = substrato competição; Forma estrutural = substrato competição; Porcentual de inibição concentrações e afinidade pela enzima. Porcentual de inibição concentrações e afinidade pela enzima.

22 Inibidores Competitivos [S] V máx = [S] V máx = K m K m Experimento Experimento 1º [E], [S] = cte1º [E], [S] = cte 2º [E], [I] = cte2º [E], [I] = cte 1/V 0 x 1/[S]

23 Inibidores Competitivos Equação de Michaelis e Menten Equação de Michaelis e Menten Lineweaver-Burk Lineweaver-Burk

24 Inibidores Competitivos Relação entre as velocidades com e sem inibidor Relação entre as velocidades com e sem inibidor [S] = influência do [I] desprezível. [S] = influência do [I] desprezível.

25 Inibidores Não-Competitivos Ocupa outro sítio ES, EI e EIS; Ocupa outro sítio ES, EI e EIS; [S] = não leva todas as E produtiva; [S] = não leva todas as E produtiva; V máx e K m normal. V máx e K m normal.

26 Inibidores Não-Competitivos Equação da velocidade: Equação da velocidade: Lineweaver-Burk Lineweaver-Burk

27 Inibidores Incompetitivos Bloqueio de ES; Bloqueio de ES; 2 sítios ativos I se fixa no complexo ES; 2 sítios ativos I se fixa no complexo ES; ESI = não forma P; ESI = não forma P; V máx e K m V máx e K m

28 Inibidores Incompetitivos Equação da velocidade: Equação da velocidade: Lineweaver-Burke: Lineweaver-Burke:

29 Inibidores Incompetitivos

30 Inibidores Irreversíveis Combinam-se com um grupo funcional destruição; Combinam-se com um grupo funcional destruição; União covalente inibidor e enzima. União covalente inibidor e enzima. V máx e K m = V máx e K m =

31 Inibidores Irreversíveis Equação de Michaelis e Menten: Equação de Michaelis e Menten:

32 Inibidores Irreversíveis Lineweaver-Burk: Lineweaver-Burk:

33 Influência do pH Valor de pH ótimo = atividade máxima; Valor de pH ótimo = atividade máxima; Velocidade da reação: pH afasta do ótimo; Velocidade da reação: pH afasta do ótimo; Influência do pH: análise dos grupos dissociáveis; Influência do pH: análise dos grupos dissociáveis; Ácidos (Brönsted): compostos capazes de dissociar-se, liberando H +. Ácidos (Brönsted): compostos capazes de dissociar-se, liberando H +.

34 Influência do pH HA A + H + pH HA A pH HA A Aminoácidos: Aminoácidos: pH -COO - captam prótons = -COOH; pH -COO - captam prótons = -COOH; pH -NH 3 + são dissociados = NH 2 ; pH -NH 3 + são dissociados = NH 2 ; Ligação eletrostática = -COO - -- NH 3 +. Ligação eletrostática = -COO - -- NH 3 +.

35 Influência do pH pH ótimo depende do número e tipo de grupos ionizáveis estrutura primária; pH ótimo depende do número e tipo de grupos ionizáveis estrutura primária; Variações do pH afeta substrato com grupos ionizáveis; Variações do pH afeta substrato com grupos ionizáveis; Estabilidade da enzima: temperatura, força iônica, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima, entre outros. Estabilidade da enzima: temperatura, força iônica, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima, entre outros.

36 Influência do pH pH 5 e 8 = não afeta a atividade; Declínio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada; 5 > pH > 8 = inativação irreversível.

37 Influência da Temperatura T velocidade de reação = energia cinética; T velocidade de reação = energia cinética; T muito elevadas = desnaturação da enzima T muito elevadas = desnaturação da enzima Rompidas as pontes de hidrogênio alterações estruturas = nova conformação;Rompidas as pontes de hidrogênio alterações estruturas = nova conformação; T desnaturação pouco acima da T ótima.T desnaturação pouco acima da T ótima.

38 Influência da Temperatura Enzimas PM 1 cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor; Efeito da T = pH, força iônica e a presença ou ausência de ligantes; Substratos protegem a enzima da desnaturação.

39 Influência da Temperatura K é função da T Lei de Arrhenius

40 Influência da Temperatura Enzimas são termolábeis reação enzimática = inativação términa Efeito da T na velocidade das reações coeficiente de temperatura Velocidade quando a T 10ºC.

41 Regulação da Atividade Sistema enzimático: produto da reação da 1ª enzima substrato da enzima subseqüente; Enzimas reguladoras determina a velocidade da seqüência; Atividade catalítica ou sinais; Moléculas sinalizadoras pequenos metabólitos ou cofatores.

42 Enzimas Alostéricas Ligação não-covalente e reversível modulador; Inibição por retroalimentação Enzima reguladora inibida pelo P final da via reequilibra as necessidades celulares; Moduladores: inibidores ou estimuladores.

43 Enzimas Alostéricas Modulador = substrato homotrópicas; Modulador substrato heterotrópicas; Sítio alostérico específico para o modulador; Curva de saturação sigmóide subunidades múltiplas.

44 Enzimas Alostéricas curvas de variação de atividade moduladores inibidores, ativadores ou os dois tipos.

45 Modificação Covalente Ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura; Ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura; Metabolismo alterado aciona vias inativas e inibem vias ativas. Metabolismo alterado aciona vias inativas e inibem vias ativas.


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