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IQB201 – Bioquímica Básica I Purificação de Proteínas Joab Trajano Silva Instituto de Química/UFRJ.

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1 IQB201 – Bioquímica Básica I Purificação de Proteínas Joab Trajano Silva Instituto de Química/UFRJ

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4 As diferenças de características das proteínas (como tamanho, ponto isoelétrico e atividade biológica) podem ser usadas para promover a purificação de uma proteína de interesse a partir de uma mistura complexa.

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6 Salting Out

7 Representação da superfície de uma proteína. As áreas vermelhas representam resíduos com cargas negativas, as áreas em azul representam resíduos com carga positiva. Quando as proteínas se enovelam, os resíduos hidrofóbicos tendem a ficar no seu interior. Entretanto, sempre ficam "patches hidrofóbicos expostos na superfície.

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10 Cromatografia Líquida

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13 Cromatografia de Exclusão em Gel

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19 (A) Acid extracts of granules obtained from human granulocytes were loaded on a Sephadex G-75 column (2.5 cm×90 cm) and eluted with 0.2 M sodium acetate, pH 4.5, as described in the Experimental section, giving peaks A–E. As indicated, the fractions in the peaks (A–E) were pooled (pools 1–5). The majority of the 75 kDa protein was contained in pool 2(a) of peak B (fractions 68–76), as indicated by the horizontal bar, as judged by SDS/PAGE after further separation of proteins in each pool on a Mono-S column (results not shown). Biochemical Journal (2005) Volume 387, N-acetylglucosamine-6-sulphatase

20 Cromatografia de Troca Iônica

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26 Figure 1 Separation of granule proteins by gel filtration and ion-exchange chromatography. (B) Ion-exchange chromatography was performed as described in the Experimental section. Fractions 68–76 from the gel filtration column were applied to the Mono-S column and eluted by a linear gradient from 0 to 1.0 M NaCl in 0.1 M sodium acetate, pH 4.0. The 75 kDa protein was eluted in fractions 11–17 of peak 2, as indicated by the horizontal bar. Biochemical Journal (2005) Volume 387,

27 Cromatografia de Afinidade

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31 Purificação da Nuclease de Staphylococcus

32 1.Eletroforese: uma técnica de separação de baseada na migração de partículas carregadas sob a ação de um campo elétrico. 2.A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis feitos de polímeros de acrilamida. 3.O gel de poliacrilamida atua como uma peneira molecular. A separação das proteínas é baseada na sua razão carga/massa. 4.A eletroforese na presença de SDS separa as proteínas com base em seu peso molecular. Eletroforese

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34 Eletroforese Sob Condições Não Desnaturantes

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36 Eletroforese Sob Condições Desnaturantes (SDS-PAGE)

37 O SDS se liga a maoiria das proteínas de forma proporcional ao seu peso molecular. A ligação do SDS à proteína confere a esta molécula um grande número de cargas negativas, tornando a carga intrínseca da proteína insignificante. A conformação nativa da proteína é alterada pela ligação com o SDS. Eletroforese Sob Condições Desnaturantes (SDS-PAGE)

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40 Após a eletroforese, as proteínas podem se visualizada por colaração com Comassie blue, que liga proteínas

41 Eletroforese Sob Condições Desnaturantes (SDS-PAGE)

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43 Isoletrofocalização é uma técnica de separação de proteínas com base em seu ponto isoelétrico. Um gradiente de pH é estabelecido por uma mistura de anfólitos que se distribuem ao longo do gel. Quando a mistura de proteínas é aplicada ao gel, cada proteína migra até atingir o pH que atinge seu pI. Isoletrofocalização

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47 Eletroforese Bidimensional

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