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Expressão Recombinante em Células Eucarióticas 1-Introdução 2-Sistemas de expressão em leveduras Edmar Vaz de Andrade.

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1 Expressão Recombinante em Células Eucarióticas 1-Introdução 2-Sistemas de expressão em leveduras Edmar Vaz de Andrade

2 1-introduçao 1-Processamento pós-traducional da proteína (glicosilação) 2-Enovelamento da proteína na conformação nativa (corpos de inclusão) 3-Degradação da proteína recombinante pela E. coli. Dificuldades em sistemas de expressão em Escherichia coli

3 2-Sistemas de expressão leveduras Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisae Fácil manipulação Cultivo relativamente rápido preservam as características favoráveis das bactérias Maior proximidade filogenética de animais do que as bactérias processamento pós-traducional comparável ao dos eucariotos pluricelulares

4 2-Sistemas de expressão leveduras Padrão de Glicosilação

5 2-Sistemas de expressão leveduras Pichia pastoris Alto rendimento de proteína recombinante Glicosilação comparável à realizada em células animais Maior eficiência de secreção

6 2-Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Origem de replicação em E. coli Gene Amp R Promotor álcool- oxidase Terminador de transcrição Peptídeo sinal Gene selvagem para biossíntese de histidina INVITROGEN

7 2-Sistemas de expressão leveduras Transformação de leveduras P. pastoris HIS4- Recombinação Homóloga INVITROGEN

8 2-Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Marca auxotrófica (nutricional) para biossíntese de histidina Cultivo em meio de cultura sem histidina Clones não transformados são inviáveis

9 2-Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Indução da síntese de proteína recombinante com adição de metanol como fonte de carbono Para inibir o promotor: cultivo na presença de glicerol como fonte de carbono Obtenção da proteína solúvel no sobrenadante


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