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Reação de Polimerização em Cadeia - PCR 1-Introdução 2-Automatização da PCR 3-Sistema de reação 4-Iniciadores – primers.

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1 Reação de Polimerização em Cadeia - PCR 1-Introdução 2-Automatização da PCR 3-Sistema de reação 4-Iniciadores – primers

2 A PCR é um sistema para a replicação do DNA in vitro, que permite que uma seqüência alvo de DNA seja amplificada em milhares de cópias em apenas algumas horas.

3 Introdução 1985 – Primeira Publicação - Science Cetus Corporation – R. Saiki; F. Faloona; G. Horn; K. Mullis; H. Erlichand; N. Arhneim. Descreveu a PCR: Fragmento específico de DNA multiplicado milhares de vezes – amplificação 1993 – Prêmio Nobel em Química Kary Mullis

4 Etapa 1: DESNATURAÇÃO 94-96˚C por 30 Etapa 2: ANELAMENTO ˚C por 1min Etapa 3: POLIMERIZAÇÃO 72˚C por 1min 1˚ Ciclo2˚ Ciclo Número de ciclos numa reação: 30 a 35 Ciclos da PCR - Gráfico

5 Taq DNA Polimerase Bactéria termoestável Thermus aquaticus

6 Termociclador Automatização da PCR Ciclos com oscilações entre altas e baixas temperaturas, controladas por computador

7 Componentes da PCR Iniciadores: Forward/Reverse Taq Polimerase Mg 2+ dCTP dGTP dATP dTTP dNTP Tampão 10x H 2 0 Milli-Q

8 4-Iniciadores - primers Tamanho – entre 10 a 30 bases Composição de bases - ~50% de G/C Seqüências – não devem ter complementaridades intra ou inter molecular Cálculo da Tm

9 Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos iniciadores Do inglês: melting temperature Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio entre a formação e a dissociação dos híbridos gerados pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio Para o cálculo: Tm= 2(A+T) + 4(G+C) 4-Iniciadores - primers

10 Medicina forense; identificação de patógenos (diagnóstico molecular); Genótipos (identificação de vírus, p. ex.)


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