Atresia das vias biliares extra-hepáticas:

Atresia das vias biliares extra-hepáticas:
Expressão gênica em um modelo experimental Autora: Elisa de Carvalho Brasília Orientador: Luiz Alberto Simeoni Co-orientador: Jorge A. Bezerra Universidade de Brasília Cincinnati Children's Hospital Medical Center

I - Introdução

AVBEH: principal indicação de transplante hepático

AVBEH: principal indicação de transplante hepático
AVBEH: 50% dos transplantes hepáticos pediátricos BALISTRERI, W. F. et al. Biliary atresia: current concepts and research directions. Summary of a symposium. Hepatology 23, (1996). Nenhuma outra patologia, nem na idade adulta, é responsável por essa monta de indicação para o transplante.

? AVBEH Complicações da portoentorostomia Complicações da doença
Colangite Colestase Progressão da hepatopatia ? Hipertensão portal Cirrose biliar Varizes esofagogástricas Hiperesplenismo Ascite Insuficiência hepática Síndrome hepatopulmonar Síndrome heparorrenal

Terapêutica: portoenterostomia

Evolução pós-portoenterostomia
Diagnóstico tardio Evolução pós-portoenterostomia

Etiopatogênese ?

Etiopatogênese Embrionária Perinatal 20 % 80 %

Histologia das vias biliares

Obstrução progressiva
das VBEH

Rotavírus rhesus do grupo A
Modelo animal: AVBEH Rotavírus rhesus do grupo A PHILLIPS, P. A. et al. Chronic obstructive jaundice induced by Reovirus type 3 in weanling mice. Pathology 1, (1969). SCHMELING, D. J. et al. Experimental obliterative cholangitis. A model for the study of biliary atresia. Ann. Surg. 213, (1991). RIEPENHOFF-TALTY, M. et al. Group A rotaviruses produce extrahepatic biliary obstruction in orally inoculated newborn mice. Pediatr. Res. 33, (1993). Durante as últimas quatro décadas, muitos pesquisadores trabalharam com o objetivo de identificar um modelo animal para a AVBEH.27,123 Apenas em 1993, Rienpenhoff-Talty et al. observaram que a inoculação de Rotavírus rhesus (RRV) do grupo A em camundongos recém-nascidos induzia o desenvolvimento de obstrução biliar temporária, similar à observada na AVBEH.30 Esse foi o passo inicial para o desenvolvimento do modelo animal da atresia biliar, consolidado em estudo subseqüente, no qual a infecção por RRV em camundongos ocasionou atresia biliar irreversível.124 As pesquisas demonstraram que a incidência de AVBEH em camundongos infectados com rotavírus depende da idade do animal, da carga viral e da via de inoculação. Quanto à idade, a maior incidência é obtida quando os animais são infectados nas primeiras 12 horas de vida, sendo impossível desencadear esse processo em camundongos mais velhos. Quando os camundongos recebem injeção intraperitoneal de RRV nas primeiras 12 horas de vida, a incidência de atresia é de 86%, com mortalidade de 100% nos animais doentes,125 em três semanas após a infecção, em geral.126 Em relação à via de inoculação e à dose, o primeiro estudo que demonstrou alterações hepatobiliares conseqüentes à infecção pelo RRV utilizou a administração oral do vírus, e a obstrução biliar foi incompleta.30 Estudos posteriores utilizaram a via intraperitoneal e obtiveram atresia irreversível dos ductos biliares.125 É importante lembrar que os camundongos que recebem doses menores que 104 unidades formadoras de fluorescência (PFU)/mL podem não desenvolver atresia, e os que são inoculados com doses maiores que 106 PFU/mL podem apresentar curso fulminante e manifestações extra-hepáticas, culminando com óbito precoce. Assim, para indução do modelo experimental da AVBEH, recomenda-se: inoculação de RRV, na dose de 106 PFU/mL, intraperitoneal, nas primeiras 12 horas de vida.125 PETERSEN, C. et al. New aspects in a murine model for extrahepatic biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 32, (1997). Camundongos Balb/c

Rotavírus rhesus do grupo A
Modelo animal: AVBEH Rotavírus rhesus do grupo A Indução: AVBEH Durante as últimas quatro décadas, muitos pesquisadores trabalharam com o objetivo de identificar um modelo animal para a AVBEH.27,123 Apenas em 1993, Rienpenhoff-Talty et al. observaram que a inoculação de Rotavírus rhesus (RRV) do grupo A em camundongos recém-nascidos induzia o desenvolvimento de obstrução biliar temporária, similar à observada na AVBEH.30 Esse foi o passo inicial para o desenvolvimento do modelo animal da atresia biliar, consolidado em estudo subseqüente, no qual a infecção por RRV em camundongos ocasionou atresia biliar irreversível.124 As pesquisas demonstraram que a incidência de AVBEH em camundongos infectados com rotavírus depende da idade do animal, da carga viral e da via de inoculação. Quanto à idade, a maior incidência é obtida quando os animais são infectados nas primeiras 12 horas de vida, sendo impossível desencadear esse processo em camundongos mais velhos. Quando os camundongos recebem injeção intraperitoneal de RRV nas primeiras 12 horas de vida, a incidência de atresia é de 86%, com mortalidade de 100% nos animais doentes,125 em três semanas após a infecção, em geral.126 Em relação à via de inoculação e à dose, o primeiro estudo que demonstrou alterações hepatobiliares conseqüentes à infecção pelo RRV utilizou a administração oral do vírus, e a obstrução biliar foi incompleta.30 Estudos posteriores utilizaram a via intraperitoneal e obtiveram atresia irreversível dos ductos biliares.125 É importante lembrar que os camundongos que recebem doses menores que 104 unidades formadoras de fluorescência (PFU)/mL podem não desenvolver atresia, e os que são inoculados com doses maiores que 106 PFU/mL podem apresentar curso fulminante e manifestações extra-hepáticas, culminando com óbito precoce. Assim, para indução do modelo experimental da AVBEH, recomenda-se: inoculação de RRV, na dose de 106 PFU/mL, intraperitoneal, nas primeiras 12 horas de vida.125 Assim, a indução da atresia em camundongos Balb/c após a infecção destes com Rotavírus rhesus do grupo A nas primeiras horas de vida124 fala a favor da hipótese de infecção como fator inicial na patogênese da atresia. Entretanto, como essa associação não é reproduzida nas diferentes populações estudadas128 e como, independentemente da agressão inicial, os pacientes atrésicos evoluem com inflamação e fibrose obliterante dos ductos biliares,129 torna-se importante avaliar o papel da expressão gênica nas vias biliares, pois as modificações desta podem comandar os processos biológicos que influenciam a evolução da doença após o agravo inicial, conforme demonstrado na Figura 3. Idade do animal < 12 horas Camundongos Balb/c Carga viral Modelo animal: bem estabelecido, como adequado para pesquisas experimentais relacionadas à atresia. 106 PFU/mL Via de inoculação Intraperitoneal

Modelo animal: AVBEH Rotavírus rhesus do grupo A RRV
Expressão gênica RRV Fator inicial: Infecção Durante as últimas quatro décadas, muitos pesquisadores trabalharam com o objetivo de identificar um modelo animal para a AVBEH.27,123 Apenas em 1993, Rienpenhoff-Talty et al. observaram que a inoculação de Rotavírus rhesus (RRV) do grupo A em camundongos recém-nascidos induzia o desenvolvimento de obstrução biliar temporária, similar à observada na AVBEH.30 Esse foi o passo inicial para o desenvolvimento do modelo animal da atresia biliar, consolidado em estudo subseqüente, no qual a infecção por RRV em camundongos ocasionou atresia biliar irreversível.124 As pesquisas demonstraram que a incidência de AVBEH em camundongos infectados com rotavírus depende da idade do animal, da carga viral e da via de inoculação. Quanto à idade, a maior incidência é obtida quando os animais são infectados nas primeiras 12 horas de vida, sendo impossível desencadear esse processo em camundongos mais velhos. Quando os camundongos recebem injeção intraperitoneal de RRV nas primeiras 12 horas de vida, a incidência de atresia é de 86%, com mortalidade de 100% nos animais doentes,125 em três semanas após a infecção, em geral.126 Em relação à via de inoculação e à dose, o primeiro estudo que demonstrou alterações hepatobiliares conseqüentes à infecção pelo RRV utilizou a administração oral do vírus, e a obstrução biliar foi incompleta.30 Estudos posteriores utilizaram a via intraperitoneal e obtiveram atresia irreversível dos ductos biliares.125 É importante lembrar que os camundongos que recebem doses menores que 104 unidades formadoras de fluorescência (PFU)/mL podem não desenvolver atresia, e os que são inoculados com doses maiores que 106 PFU/mL podem apresentar curso fulminante e manifestações extra-hepáticas, culminando com óbito precoce. Assim, para indução do modelo experimental da AVBEH, recomenda-se: inoculação de RRV, na dose de 106 PFU/mL, intraperitoneal, nas primeiras 12 horas de vida.125 Assim, a indução da atresia em camundongos Balb/c após a infecção destes com Rotavírus rhesus do grupo A nas primeiras horas de vida124 fala a favor da hipótese de infecção como fator inicial na patogênese da atresia. Entretanto, como essa associação não é reproduzida nas diferentes populações estudadas128 e como, independentemente da agressão inicial, os pacientes atrésicos evoluem com inflamação e fibrose obliterante dos ductos biliares,129 torna-se importante avaliar o papel da expressão gênica nas vias biliares, pois as modificações desta podem comandar os processos biológicos que influenciam a evolução da doença após o agravo inicial, conforme demonstrado na Figura 3. Camundongos Balb/c Inflamação e fibrose obliterante As modificações da expressão gênica comandam os processos biológicos que influenciam a evolução da doença após o a lesão inicial.

Hipótese do estudo Genoma Ativação ou desativação reacional de genes
Inoculação de RRV Ativação ou desativação reacional de genes Reprogramação da função celular (Estimulação ou inibição de processos biológicos) Fibrose progressiva com obliteração das VBEH

II - Objetivos

Objetivo geral Analisar o transcriptoma (expressão gênica) das vias biliares extra-hepáticas, em modelo experimental de AVBEH, nas diferentes fases da evolução dessa doença.

Objetivos específicos
Identificar os genes ativados e os desativados, nos camundongos infectados pelo RRV, em relação ao grupo controle, nos diferentes estágios da obstrução biliar. Avaliar os processos biológicos que se correlacionam ao desenvolvimento da atresia das vias biliares extra-hepáticas. Identificar e analisar as vias moleculares que regulam o dano celular e a obliteração das vias biliares extra-hepáticas.

III - Métodos

Estudo experimental, randomizado e controlado.
Desenho do estudo Estudo experimental, randomizado e controlado.

114 camundongos Balb/c: menores que 24 horas de vida
filhos de mães negativas para o RRV Grupo A (modelo animal de AVBEH): 63 camundongos injeção intraperitoneal: 1,5 x 106 UFF de Rotavírus rhesus do grupo A (20 μL) primeiras 24 horas de vida Excluídos: animais do grupo A que não desenvolveram AVBEH. Grupo B (grupo controle): 51 camundongos Injeção intraperitoneal: 20 μL de soro fisiológico 0,9%, primeiras 24 horas de vida.

Dia 3 Dias 7 e 14 102 Camundongos Balb/c (< 24 horas de vida)
Inoculação intraperitoneal com RRV Inoculação intraperitoneal com SF 0,9% Grupo A: 51 camundongos (modelo animal de AVBEH) Grupo B: 51 camundongos (grupo controle) Clínica: peso, icterícia, colúria e acolia fecal Laboratorial: bilirrubinúria Anestesia: Microdissecção e ressecção das vias biliares Retirada de dois fragmentos hepáticos Animais sacrificados com: 03 dias de vida: subgrupos A1 e B1 07 dias de vida subgrupos: A2 e B2 14 dias de vida subgrupos: A3 e B3 03 amostras RNA: Microarranjos 03 amostras RNA: RT PCR 03 amostras Histologia: VB Dia 3 Dias 7 e 14 Amostra 01 Amostra 01

Avaliação da expressão gênica
Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip® Reação em cadeia da polimerase em tempo real Novas tecnologias GeneChip: permite a avaliação do transcriptoma (perfil de “funcionamento” de todos os genes em um momento específico - níveis de mRNAs dos genes expressos) em um único ensaio. RT PCR: teste de maior acurácia para determinação da expressão gênica.

Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip®
Várias seqüências de nucleotídeos (representando todo o genoma) são depositadas em uma superfície de vidro (o chip) e cada oligonucleotídeo configura uma sonda para um gene específico.

Extração: RNA das vias biliares RNA
Homogeneização e lise celular (TRIzol) Fase da separação (fenol/clorofórmio) RNA Lipídeos Carboidratos Proteínas Precipitação (isopropanol) RNA RNA TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA

Qualidade do RNA

Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip®
Local de origem do sinal de fluorescência e a intensidade deste identifica o gene em questão e seu nível de expressão.

Unidade de expressão: pixel
Quantificação do sinal de fluorescência: sistema GeneChip® Unidade de expressão: pixel

Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring

Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring
Avaliação conjunta dos resultados de todas as amostras. Comparação entre os grupos experimental e controle. Avaliação estatística. Classificação dos genes em funções biológicas (Gene Ontology).

Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos
GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos O valor da expressão dos genes no GeneSpring é um valor relativo (ou normalizado) em relação ao controle. Segunda etapa: As amostras do grupo controle foram usadas como valor basal. A intensidade do sinal de cada gene no grupo experimental foi dividida pelo valor do mesmo gene no grupo controle, o que foi realizado separadamente para os dias 3, 7 e 14. Primeira etapa: Média de todos os sinais da expressão gênica. Este valor é dividido por cada um dos sinais individualmente. Objetivo: evitar valores extremos. Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)

GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle Seleção dos genes (Anova p < 0,01) Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)

GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels em pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo (Diagrama de Venn) Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle Seleção dos genes (Anova p < 0,01) Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)

GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos Reclassificação dos genes (PubMed, GeneCard, UniGene, Gene, GeneBank) Seleção dos processos biológicos (Anova p < 0,05) Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels em pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo (Diagrama de Venn) Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle Seleção dos genes (Anova p < 0,01) Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)

Validação dos resultados do GeneChip
Reação em cadeia da polimerase em tempo real

RT PCR: Quantificação do número de cópias
Sinal de fluorescência: SYBR Green

Curva de amplificação da RT PCR com várias amostras

Fluorescência emitida Quantidade de cópias inicial da amostra
Curva de amplificação da RT PCR e definição do CT Platô Linha que delimita o nível de detecção do sinal de fluorescência Amostra Fluorescência emitida Threshold Amostra: sem DNA Região da linha de base CT Número de ciclos Quantidade de cópias inicial da amostra

Cálculo da expressão gênica
Expressão de um gene Quantidade de cópias do gene-alvo Quantidade de cópias do gene padrão Variação da expressão Expressão do gene no grupo experimental Expressão do gene no grupo controle Gene padrão: 18S. Animais do grupo experimental e do controle.

Especificidade dos microarrranjos: árvore biliar extra-hepática
Expressão da citoqueratina-7 (Krt2-7): Fígado e árvore biliar extra-hepática Validação: RT PCR

IV - Resultados

Incidência de AVBEH: animais infectados por RRV
63 camundongos AVBEH: 51 camundongos (81%) Outros estudos: 67% a 86% Petersen C et al., 1997; Czech-schmidt G et al., 2001; Shivakumar P et al., 2004

X Evolução da infecção pelo RRV Icterícia Colúria Acolia fecal
AVBEH: quadro clínico Ausência: Quadro diarréico Esse quadro clínico contrasta com o relato de doença diarréica importante em humanos152 e com a ausência de sintomas biliares em animais infectados por RRV mais tardiamente (5 a 7 dias de vida),153 e constitui um indício de que o tropismo do RRV pelos colangiócitos tem brevidade cronológica e não persiste com o crescimento e o amadurecimento do animal. X Humanos: diarréia importante (O'ryan M. et al., 2005) Animais mais velhos: ausência de icterícia (Feng N. et al., 1994)

Camundongos RRV: tropismo pelos colangiócitos Brevidade cronológica
Não persiste com o crescimento e o amadurecimento do animal RRV: tropismo único pelas células do epitélio biliar neonatal (Shivakumar et al., 2004)

Imaturidade temporária: relacionada à idade precoce
De modo similar em humanos: Atresia é observada apenas em lactentes nos primeiros três meses de vida, não se desenvolvendo em crianças maiores ou em adultos. BALISTRERI, W. F. Neonatal cholestasis. J. Pediatr. 106, (1985). BEZERRA, J. A. & BALISTRERI, W. F. Cholestatic syndromes of infancy and childhood. Semin. Gastrointest. Dis. 12, (2001). Imaturidade temporária: relacionada à idade precoce Pode desempenhar um papel importante na história natural dessa doença.

Aspecto macroscópico das vias biliares extra-hepáticas
Nos animais infectados que desenvolveram colestase, a obstrução dos ductos biliares extra-hepáticos, em pelo menos um segmento, foi confirmada pelo aspecto macroscópico da árvore biliar, bem como pelos achados histológicos das vias biliares extra-hepáticas e do fígado. Nesses animais, os achados macroscópicos caracterizados por vesícula biliar pequena e contraída e vias biliares extra-hepáticas estreitadas e obliteradas, também descritos por outros autores no modelo animal,127 são semelhantes aos observados nas crianças atrésicas, as quais apresentam, no momento do diagnóstico, remanescentes dos ductos biliares compostos de tecido fibroso.157 Esta é mais uma similaridade entre o modelo animal em questão e a AVBEH dos lactentes, que confere credibilidade à utilização desse modelo experimental em pesquisas para o estudo da atresia. Os aspectos histológicos serão discutidos a seguir. Vesícula biliar distendida . Vesícula biliar pequena e contraída. Vias biliares de aspecto normal. Vias biliares estreitas e fibrosadas.

Avaliação histológica das vias biliares
Grupo controle Dia 3 Dia 7 Dia 14 Grupo experimental Dia 3 Dia 7 Dia 14 O estudo histológico das vias biliares extra-hepáticas demonstrou a presença de lesão do epitélio dos ductos biliares, colangite e intenso infiltrado inflamatório, que ocasionou obstrução parcial do lúmen biliar em segmentos da árvore extra-hepática no dia 7; bem como obliteração das vias biliares por células inflamatórias e deposição da matriz extra-celular, nos animais sacrificados no dia 14. Esses achados, também obtidos no modelo animal por Shivakumar el al.,36 apresentam similaridades e diferenças quando comparados aos observados nos pacientes atrésicos. De modo similar, as crianças demonstram, no momento da portoenterostomia, ductos extra-hepáticos circundados por fibrose, inflamação e estreitamento importante ou completa obstrução luminal; mas, de modo diferente, o processo inflamatório observado nesses pacientes é, geralmente, menos pronunciado, provavelmente porque eles já estejam em uma fase mais avançada do processo obstrutivo, quando a inflamação já está em fase quiescente. Barra preta: 100 μm

Peso médio dos camundongos
SF 0,9% RRV * * * * * * * * Peso médio dos camundongos relacionado aos dias seguidos à inoculação com SF0,9% ou RRV, com p < 0,01 dos dias 7 a 14.

Aspectos macroscópicos Histologia Evolução
Modelo animal: Idade Sinais clínicos Aspectos macroscópicos Histologia Evolução ss Hipodesenvolvimento: Redução da ingesta alimentar Esteatorréia Fenótipo da AVBEH em crianças

Avaliação histológica do fígado
Grupo controle Dia 3 Dia 7 Dia 14 Grupo experimental Outro aspecto a ser considerado na histologia hepática é a persistência do infiltrado inflamatório portal nos animais sacrificados no dia 14. Segundo outros autores, os pacientes atrésicos apresentam, no momento do diagnóstico, remanescentes dos ductos biliares constituídos de tecido fibroso e escassos linfócitos,157 enquanto os ductos intra-hepáticos são circundados por infiltrado inflamatório misto, composto por linfócitos, macrófagos e eosinófilos.158 Assim, de modo interessante, em crianças, o infiltrado inflamatório no fígado pode ser maior do que no remanescente da árvore biliar extra-hepática, provavelmente porque no momento da cirurgia o processo imune da árvore biliar já esteja quiescente,9 como já mencionado. Os mecanismos responsáveis pela persistência do infiltrado inflamatório que circundam os ductos biliares intra-hepáticos, nos espaços porta, tanto no modelo animal quanto em crianças, ainda não estão estabelecidos, mas três possibilidades devem ser avaliadas: a colestase, o próprio vírus ou os fenômenos imunes. Dia 3 Dia 7 Dia 14

Papel do vírus RRV (vias biliares e tecido hepático):
identificado nos animais sacrificados com 7 dias Não foi isolado naqueles sacrificados com 14 dias. SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary atresia. J. Clin. Invest 114, (2004). MACK, C. L. et al. Armed CD4+ Th1 effector cells and activated macrophages participate in bile duct injury in murine biliary atresia. Clin. Immunol. 115, (2005). Efeito citopático direto do vírus Em relação ao papel do vírus, dois estudos demonstraram, em modelo animal de atresia similar ao utilizado neste trabalho, a presença do RRV nas vias biliares e no tecido hepático dos animais sacrificados com 7 dias, o que não se repetiu naqueles sacrificados com 14 dias. Nessa fase, não foi possível identificar o agente que induziu à atresia, apesar de sabermos que a lesão hepática progride até culminar com o óbito do animal, por volta de 2 a 4 semanas de vida.36,154 Esses achados são consistentes com os publicados por Riepenhoff-Talty,30 que também em pesquisa experimental com camundongos infectados pelo RRV demonstraram o clearance viral entre a primeira e a segunda semana após a infecção, e inconsistentes com a possibilidade do efeito citopático direto do vírus. Assim, a evolução da infecção credita aos processos imunes potencial papel na evolução da doença. Potencial papel dos processos imunes na evolução da doença. Infiltrado linfocitário periductular Predomínio: linfócitos TH1 e CTLs. SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary atresia. J. Clin. Invest 114, (2004).

Transcriptoma das vias biliares

Árvore genética: GeneSpring
Transcriptoma das vias biliares ( genes transcritos) Anova p < 0.01 Genes ativados ou desativados < 2x ou > 2x Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels 849 genes Seleção dos processos biológicos Anova p < 0,05 3SF 3RRV 7SF 7RRV 14SF 14RRV Árvore genética: GeneSpring E e Alto Baixo demonstrando que a infecção pelo RRV desencadeou uma série de processos moleculares. Para correlacionar os padrões de expressão gênica aos processos biológicos, na atual pesquisa,150 foi feito um agrupamento hierárquico de genes, que demonstrou um padrão distinto de ativação destes, altamente específico no grupo experimental em relação ao controle. A análise funcional revelou a ativação dos genes reguladores da imunidade, das enzimas e das proteínas estruturais em todas as etapas do estudo; e uma expressão de genes relacionados ao controle da transcrição e tradução, da apoptose, do transporte e da transdução de sinais, em períodos específicos da pesquisa (Figura 50), aspectos abordados a seguir. A análise dos transcriptomas das vias biliares nas diferentes etapas da pesquisa (dias 3, 7 e 14) selecionou 498 genes ativados ou silenciados, em relação ao grupo controle, em pelo menos uma etapa da pesquisa. Desse total, 310 genes (62%) estavam ativados (Tabela 12), demonstrando que a infecção pelo RRV desencadeou uma série de processos moleculares.

Dia 3 Dia 7 Dia 14 Ativados: 310 genes (62%) 359 genes
Reclassificação funcional dos genes (PubMed, UniGene, Gene, GeneCard, GeneBank) Dia 3: Imunidade Enzimas Proteínas estruturais Transporte Transcrição e tradução Dia 7: Imunidade Enzimas Proteínas estruturais Apoptose Transdução de sinais Dia 14: Imunidade Enzimas Proteínas estruturais Transcrição e tradução Transdução de sinais Ativados: 310 genes (62%) 498 genes demonstrando que a infecção pelo RRV desencadeou uma série de processos moleculares. Para correlacionar os padrões de expressão gênica aos processos biológicos, na atual pesquisa,150 foi feito um agrupamento hierárquico de genes, que demonstrou um padrão distinto de ativação destes, altamente específico no grupo experimental em relação ao controle. A análise funcional revelou a ativação dos genes reguladores da imunidade, das enzimas e das proteínas estruturais em todas as etapas do estudo; e uma expressão de genes relacionados ao controle da transcrição e tradução, da apoptose, do transporte e da transdução de sinais, em períodos específicos da pesquisa (Figura 50), aspectos abordados a seguir. A análise dos transcriptomas das vias biliares nas diferentes etapas da pesquisa (dias 3, 7 e 14) selecionou 498 genes ativados ou silenciados, em relação ao grupo controle, em pelo menos uma etapa da pesquisa. Desse total, 310 genes (62%) estavam ativados (Tabela 12), demonstrando que a infecção pelo RRV desencadeou uma série de processos moleculares. Dia Dia Dia 14

Classificação funcional dos genes ativados nos dias 3, 7 e 14.
ll Transdução de sinal Apoptose Transcrição e tradução Transporte Proteína estrutural Enzima Imunidade A figura demonstra o perfil dos genes ativados nos camundongos infectados pelo RRV em relação ao grupo controle, agrupados conforme a função biológica e a etapa da pesquisa (dias 3, 7 e 14). Observa-se que os processos biológicos relacionados à imunidade, às enzimas e às proteínas estruturais foram selecionados em todas as etapas da pesquisa, enquanto os outros processos apenas nas fases especificadas na figura. Nota-se que o maior número de genes ativados corresponde aos processos imunes no dia 7. Dia Dia Dia 14 Genes ativados Imunidade: três etapas da pesquisa. Maior número de genes ativados: processos imunes no dia 7.

Imunidade Dia 3

Fase precoce da lesão biliar (dia 3)
Imunidade inata Imunidade adquirida

Células fagocitárias (neutrófilos e macrófagos) Frações do complemento
Imunidade inata Células fagocitárias (neutrófilos e macrófagos) Frações do complemento A resposta imune inata fornece a linha de defesa inicial contra os microrganismos, incluindo os vírus, e influencia na natureza e na qualidade da resposta imune adaptativa subseqüente. Os seus principais componentes, além das barreiras físicas e químicas, são Como demonstrado na Tabela 29, ocorreu aumento da expressão do gene Tyki, o que traduz a presença de ativação macrofágica164 no transcriptoma do dia 3. A presença de macrófagos nos espaços porta dos pacientes atrésicos já foi relatada por outros autores37,165 e, de modo interessante, a sua intensidade parece ter correlação direta com o pior prognóstico. Kobayashi et al.166 observaram grande número de macrófagos no espaço porta, no momento do diagnóstico, dos pacientes que não apresentaram drenagem biliar satisfatória após o Kasai, o que também foi evidenciado por Davenport et al..34 Outro componente da imunidade inata revelado no transcriptoma do dia 3 foi o complemento. Houve aumento da expressão do C1R, o que constitui um indício da ativação da cascata do complemento na fase precoce da infecção, pela via clássica.167 Esta pode ser iniciada pela ligação do componente C1, a primeira proteína da cascata do complemento, diretamente à superfície do patógeno, ou também pode ser ativada durante a resposta imune adquirida, pela sua ligação ao complexo antígeno-anticorpo, sendo esta uma das chaves da interação entre os mecanismos efetores da imunidade inata e adquirida.168 Além disso, em 2004, Ritchie et al. demonstraram a primeira evidência direta do papel do USP18 na imunidade inata contra infecção viral.169 Todos esses aspectos são evidências consistentes de que os mecanismos da imunidade inata foram deflagrados nos camundongos do grupo experimental, na fase inicial da lesão biliar. Tyki C1R Ativação macrofágica Ativação da cascata de complemento

Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+
PSMB8 TAP2, TAPBP

As moléculas da classe I são expressas em quase todas as células nucleadas, enquanto as da classe II são encontradas, em geral, nas células dendríticas, nos linfócitos B, nos macrófagos e em raros tipos celulares. Esse padrão de expressão relaciona-se às funções das células T, restritas à classe I ou II. A função das células T CD8+ restritas à classe I é eliminar as células infectadas por microrganismos intracelulares, como os vírus. Como estes podem infectar praticamente qualquer célula nucleada, os ligantes que as células T CD8+ reconhecem precisam estar em todas as células nucleadas. Assim, a expressão do MHC na superfície celular é essencial para o reconhecimento do antígeno e para os passos seqüenciais da resposta imune.170 A expressão das moléculas do MHC é aumentada pelas citocinas produzidas durante as respostas imunológicas natural e adquirida. O aumento da transcrição, induzido pelas citocinas, é o principal determinante da síntese e da expressão de moléculas MHC das classes I e II na superfície celular. Esses efeitos são mediados pela ligação de fatores de transcrição ativados pelas citocinas às seqüências reguladoras do DNA na região do promotor dos genes do MHC. Os interferons alfa, beta e gama aumentam o nível de expressão das moléculas da classe I.173 Como observado na Tabela 29, observou-se aumento da expressão dos genes IRF7 e IRF9 que se relacionam ao aumento da produção dos interferons tipos I e II o que justifica a observação do aumento da expressão do MHC da classe I no transcriptoma do dia 3. Pelos aspectos descritos, esse aumento da expressão contribui para a intensificação dos processos imunes, pois toda a cascata de eventos das respostas imunes são desencadeadas após o reconhecimento do antígeno. Como o aumento da expressão do MHC da classe I foi precoce e provavelmente estimulado pelos interferons na fase inicial da resposta imunológica natural contra o vírus, este é um outro mecanismo pelo qual a imunidade inata pode estimular a resposta adquirida. Ademais, o interferon aumenta a transcrição não apenas dos genes do MHC, mas também dos genes que codificam as subunidades do proteossomo e das subunidades do TAP,170 observados no transcriptoma do dia 3. PSMB8 TAP2, TAPBP H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10

PSMB8 TAP2, TAPBP Imunidade celular H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10

Etapas da imunidade adquirida
Ativação dos linfócitos LY6E LY6A Em relação à proliferação e à diferenciação celular, observamos aumento da expressão de genes LY6A e LY6E, responsáveis pela ativação dos linfócitos, completando os Dias após a exposição ao antígeno

Receptores dos interferons e ativação da via clássica JAK-STAT
IRF9 IFIT1

Imunidade adquirida: dia 3
Processamento e apresentação do antígeno Aumento da expressão do MHC da classe I Fatores reguladores dos interferons Estimulação dos linfócitos T Imunidade humoral Imunidade celular BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of proinflammatory immunity in children with biliary atresia. Lancet 360, (2002).

Imunidade No início da obstrução biliar pelas células inflamatórias, o transcriptoma do dia 7 selecionou genes que, de modo similar ao dia 3, também estão envolvidos com as imunidades inata e adquirida (Tabela 30), mas com peculiaridades, discutidas a seguir, que não foram observadas na fase precoce da lesão biliar. Dia 7

Imunidade inata: complemento
C1R – Dia 3 C1Qα, C1Qβ C3αR1 Foram ativados genes que aumentam a produção, são quimiotáticos ou ativadores para macrófagos, neutrófilos e células NK, conforme descrito na Tabela 30. Os macrófagos e os neutrófilos reconhecem os patógenos por meio de receptores de superfície, em seguida os fagocitam e os destroem. Além da fagocitose, essas células produzem uma variedade de produtos tóxicos que ajudam na destruição do microrganismo englobado. Os mais importantes destes são o peróxido de hidrogênio (H2O2), o ânion superóxido (O2) e o óxido nítrico (NO), que são diretamente tóxicos contra patógenos. Estes são gerados por NADPH oxidases lisossomais e outras enzimas em um processo denominado respiração oxidativa, pois é acompanhado por um consumo transitório de oxigênio.182 Componentes críticos da oxidase de membrana dos fagócitos, que geram produtos superóxidos, foram expressos nessa fase da pesquisa (Tabela 30), demonstrando produção dos derivados tóxicos do oxigênio, o que pode contribuir no combate a infecções. É importante lembrar que as células fagocitárias são importantes tanto na imunidade natural como na adquirida. Na natural, fagocitam microrganismos e produzem citocinas que recrutam e ativam outras células inflamatórias. Na adquirida, estimulados pelas células T e citocinas como o interferon gama, destroem os antígenos fagocitados. Além disso, os macrófagos ativados produzem citocinas como a IL-12 e a IL-18, que atuam em conjunto para promover a diferenciação celular em TH1, o que demonstra mais um mecanismo de interação entre as respostas imunes inatas e adquiridas.183 Já foi demonstrado aumento da expressão (mRNA) da IL-12 em fígado de pacientes portadores de atresia no momento do diagnóstico,37 e Urushihara et al. observaram ativação macrofágica com aumento da IL-18 no soro em pacientes atrésicos.184 Nesta pesquisa, não foi observado ativação dos genes que codificam as interleucinas 12 e 18, mas houve evidências do aumento de produção do interferon gama e da polarização da resposta imune para TH1, dados que serão abordados neste item.

Citotoxicidade mediada por anticorpos
FcγRIIIA (CD16) FcγRIII (CD16) Célula NK ativada Célula NK O aumento da expressão dos genes FcγRIIB (CD 32), e FcγRI (CD 64) sugere que pode estar ocorrendo o mecanismo de citotoxicidade mediada por anticorpos (ADCC), processo no qual as células NK e outros leucócitos se ligam a células recobertas por anticorpos por meio dos receptores Fc e as destroem. As células NK expressam o receptor CD16, o qual reconhece as subclasses IgG 1 e IgG3 e ativa o ataque citotóxico pela célula NK às células-alvo recobertas por anticorpos. O mecanismo de ataque é análogo ao das células T citotóxicas, envolvendo a liberação de grânulos citoplasmáticos repletos de perforina e granzimas.186 A importância da citotoxicidade mediada por anticorpos na defesa contra a infecção por vírus não está estabelecida, porém pode representar um outro mecanismo pelo qual, por meio de um engajamento do receptor Fc, os anticorpos podem dirigir um ataque antígeno-específico por uma célula efetora que não possui especificidade pelo antígeno. Em relação aos pacientes atrésicos, a presença desse mecanismo ainda não tinha sido relatada no processo obliterativo, e outros estudos são necessários para elucidar sua participação. Ac liga-se ao antígeno na superfície do patógeno Receptores Fc (NK) reconhecem os Ac Sinalização para célula NK matar a célula-alvo A célula alvo morre por apoptose

Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos: linfócito T CD4+
Catepsinas Biossíntese do MHC da classe II Em relação ao processamento e à apresentação de antígenos, como no dia 3, houve aumento da expressão dos genes que se associam à apresentação de antígenos ao MHC da classe I, mas, de modo diferente, nessa fase da pesquisa, o transcriptoma também demonstrou a ativação de genes que processam peptídeos para o MHC da classe II, bem como do próprio MHC da classe II. Grande expressão do HLA-DR (MHC classe II) já foi observada nas células de Kupffer e em menor grau nas células do epitélio dos ductos biliares intra-hepáticos de pacientes portadores de atresia.166,187 Feng et al. sugeriram que a expressão anômala do HLA-DR nos ductos biliares intra-hepáticos de pacientes com atresia biliar pode contribuir para a lesão progressiva destes.188 A expressão das moléculas do MHC da classe II, que apresentam os antígenos aos linfócitos T CD4+, também é controlada por várias citocinas. O interferon gama, cujo aumento do mRNA foi detectado pela RT PCR nessa fase da pesquisa, é a principal citocina envolvida na estimulação da expressão das moléculas do MHC da classe II nas células apresentadoras de antígenos, como os macrófagos. Além disso, a maioria das células que não pertence ao sistema imunológico e que não tem a molécula MHC da classe II pode passar a expressá-la, se exposta a altos níveis de interferon gama. Lembramos que como essa citocina pode ser produzida pelas células NK e pelas células T ativadas por antígenos, a sua habilidade em aumentar a expressão das moléculas do MHC classe II nas células apresentadoras de antígenos representa um outro exemplo de como a imunidade inata pode estimular a adquirida, bem como um mecanismo de amplificação da imunidade adquirida.173 Outro aspecto a ser considerado é que, embora a maioria dos peptídeos de ligação ao MHC da classe II seja derivada de proteínas interiorizadas do meio extracelular, as proteínas citoplasmáticas e de membrana podem, ocasionalmente, entrar na vias da classe II. Isso pode ocorrer por mecanismo de autofagia ou porque, após a sua expressão na superfície celular, algumas proteínas de membrana entram novamente na célula pela mesma via endocitária que as proteínas extracelulares. Desse modo, os vírus, que se replicam no citoplasma de células infectadas, podem produzir proteínas citoplasmáticas e de membranas que são degradadas em peptídeos que entram na via do MHC da classe II da apresentação de antígenos. Este pode ser um mecanismo para ativação de linfócitos T CD4+ antígeno-específico.170 IFNG H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 Expressão anômala do MHC da classe II nos ductos biliares: lesão progressiva BROOME, U. et al. Different expression of HLA-DR and ICAM-1 in livers from patients with biliary atresia and Byler's disease. J. Hepatol. 26, (1997). FENG, J. et al. The aberrant expression of HLA-DR in intrahepatic bile ducts in patients with biliary atresia: an immunohistochemistry and immune electron microscopy study. J. Pediatr. Surg. 39, (2004). KOBAYASHI, H. et al. Hepatic overexpression of MHC class II antigens and macrophage-associated antigens (CD68) in patients with biliary atresia of poor prognosis. J. Pediatr. Surg. 32, (1997).

Receptores das células
H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 Receptores das células T e seus ligantes Reconhecimento do antígeno TCRB-V13 Redistribuição dos receptores e seus ligantes Sinapse imunológica

Receptores das células
H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 Receptores das células T e seus ligantes Reconhecimento do antígeno TCRB-V13 LFA1 Redistribuição dos receptores e seus ligantes Moléculas de adesão intercelular Sinapse imunológica Linfócitos do infiltrado inflamatório do espaço porta de pacientes atrésicos.33 Células do infiltrado inflamatório de tecido hepático e a árvore biliar remanescente de pacientes atrésicos34 Moléculas de adesão: papel significativo na reação inflamatória na atresia biliar, por ocasionarem atração, retenção e ativação dos leucócitos circulantes. DILLON, P. W. et al. Differential expression of the major histocompatibility antigens and ICAM-1 on bile duct epithelial cells in biliary atresia. Tohoku J. Exp. Med. 181, (1997). DAVENPORT, M. et al. Immunohistochemistry of the liver and biliary tree in extrahepatic biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 36, (2001).

H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 TCRB-V13 LFA1 CD45R HCK
Receptores das células T e seus ligantes TCRB-V13 LFA1 Reconhecimento do antígeno Outro evento de sinalização intracelular é a fosforilação das tirosinas, por tirosinas cinases da família Src. Redistribuição dos receptores e seus ligantes CD45R Determina a atividade de sinalização das cinases da família Src. HCK Sinapse imunológica

H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 TCRB-V13 LFA1 CD45R
Receptores das células T e seus ligantes TCRB-V13 Reconhecimento do antígeno LFA1 CD45R Redistribuição dos receptores e seus ligantes Dia 7 Componentes essenciais: sinapse imunológica Sinapse imunológica Fundamental: ativação dos mecanismos de sinalização intracelular na ativação da célula T Regulam a produção de citocinas.

Pergunta: predomínio TH1 ou TH2?
Desenvolvimento das subpopulações das células T IL2RG Ativação das células T Principal citocina: célula T naive. Estágio inicial: diferenciação da célula T Proliferação e a expansão clonal das células T naive Crescimento e diferenciação das células T. Polarização: citocina Subpopulações: TH1 e TH2 Etapas do desenvolvimento dos linfócitos. Pergunta: predomínio TH1 ou TH2? A proporção relativa dessas subpopulações é o principal determinante das funções protetoras e das conseqüências patológicas da resposta imune.

TH1 e TH2: citocinas e funções efetoras diferentes
IFNG As células TH1 são estimuladas pela IL-12 e produzem interferon gama, IL-2, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa e TNF-beta; enquanto as células TH2 são estimuladas pela IL-4 e produzem IL-4, IL-5 e IL-10. A infecção por vírus, utilizada nesta pesquisa para indução do modelo animal, estimula a diferenciação em TH1, por desencadear uma reação imune inata com produção de IL-12, por macrófagos ativados ou células dendríticas. Essa citocina liga-se aos receptores das células T CD4+ estimuladas pelo antígeno e ativa a transcrição do fator STAT-4, que promove a diferenciação das células T em TH1. O interferon gama também promove o desenvolvimento de células TH1, estimulando a produção de IL-12 pelos macrófagos e aumentando a expressão de receptores funcionais de IL-12 nos linfócitos T. Dessa forma, o interferon gama é a citocina que estabelece a presença de atividade das células TH1, enquanto a IL-4 e IL-5 são as que definem as células TH2. Essas citocinas, consideradas marcadores fenotípicos dessas células, determinam as funções celulares e participam no desenvolvimento e na expansão das respectivas subpopulações, polarizando a resposta imune para TH1 ou TH2. Isso significa que o interferon gama secretado pelas células TH1 promove a diferenciação adicional em TH1 e inibe a de TH2. De modo contrário, a IL-4 produzida pelos linfócitos TH2 promove a diferenciação em TH2; e a IL-10, também produzida pelas células TH2, inibe a ativação dos linfócitos TH1. Assim, cada subpopulação amplifica o seu clone e inibe o da outra. Por essa razão, uma vez que uma resposta imune se desenvolve ao longo de uma via, ela se torna cada vez mais polarizada naquela direção (Figura 54), e a polarização mais extrema é vista nas infecções crônicas ou na exposição a antígenos ambientais, quando a estimulação imune é persistente.195

Ações biológicas do interferon gama
As células T naive, estimuladas pelo antígeno, podem diferenciar-se em linfócitos T CD4+ e T CD8+. Além disso, durante a inflamação, sob diferentes condições de ativação, as células T CD4+ naive diferenciam-se em células efetoras TH1 e TH2, que produzem diferentes citocinas e que desempenham diferentes funções efetoras. As células TH1 são estimuladas pela IL-12 e produzem interferon gama, IL-2, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa e TNF-beta; enquanto as células TH2 são estimuladas pela IL-4 e produzem IL-4, IL-5 e IL-10. A infecção por vírus, utilizada nesta pesquisa para indução do modelo animal, estimula a diferenciação em TH1, por desencadear uma reação imune inata com produção de IL-12, por macrófagos ativados ou células dendríticas. Essa citocina liga-se aos receptores das células T CD4+ estimuladas pelo antígeno e ativa a transcrição do fator STAT-4, que promove a diferenciação das células T em TH1. O interferon gama também promove o desenvolvimento de células TH1, estimulando a produção de IL-12 pelos macrófagos e aumentando a expressão de receptores funcionais de IL-12 nos linfócitos T. Dessa forma, o interferon gama é a citocina que estabelece a presença de atividade das células TH1, enquanto a IL-4 e IL-5 são as que definem as células TH2. Essas citocinas, consideradas marcadores fenotípicos dessas células, determinam as funções celulares e participam no desenvolvimento e na expansão das respectivas subpopulações, polarizando a resposta imune para TH1 ou TH2. Isso significa que o interferon gama secretado pelas células TH1 promove a diferenciação adicional em TH1 e inibe a de TH2. De modo contrário, a IL-4 produzida pelos linfócitos TH2 promove a diferenciação em TH2; e a IL-10, também produzida pelas células TH2, inibe a ativação dos linfócitos TH1. Assim, cada subpopulação amplifica o seu clone e inibe o da outra. Por essa razão, uma vez que uma resposta imune se desenvolve ao longo de uma via, ela se torna cada vez mais polarizada naquela direção (Figura 54), e a polarização mais extrema é vista nas infecções crônicas ou na exposição a antígenos ambientais, quando a estimulação imune é persistente.195 (A) Ativação de macrófagos, que passam a apresentar maior atividade microbicida. (B) Nas células B, promove a troca do isótopo para anticorpos opsonizantes e fixadores de complemento. (C) Promove a diferenciação das células T CD4+ naive para a subpopulação TH1 e inibe a proliferação das células TH2. (D) Aumenta da expressão das moléculas do MHC das classes I e II.

Citocina: estabelece a presença de atividade das células TH1.
TH1 e TH2: citocinas e funções efetoras diferentes IFNG As células TH1 são estimuladas pela IL-12 e produzem interferon gama, IL-2, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa e TNF-beta; enquanto as células TH2 são estimuladas pela IL-4 e produzem IL-4, IL-5 e IL-10. A infecção por vírus, utilizada nesta pesquisa para indução do modelo animal, estimula a diferenciação em TH1, por desencadear uma reação imune inata com produção de IL-12, por macrófagos ativados ou células dendríticas. Essa citocina liga-se aos receptores das células T CD4+ estimuladas pelo antígeno e ativa a transcrição do fator STAT-4, que promove a diferenciação das células T em TH1. O interferon gama também promove o desenvolvimento de células TH1, estimulando a produção de IL-12 pelos macrófagos e aumentando a expressão de receptores funcionais de IL-12 nos linfócitos T. Dessa forma, o interferon gama é a citocina que estabelece a presença de atividade das células TH1, enquanto a IL-4 e IL-5 são as que definem as células TH2. Essas citocinas, consideradas marcadores fenotípicos dessas células, determinam as funções celulares e participam no desenvolvimento e na expansão das respectivas subpopulações, polarizando a resposta imune para TH1 ou TH2. Isso significa que o interferon gama secretado pelas células TH1 promove a diferenciação adicional em TH1 e inibe a de TH2. De modo contrário, a IL-4 produzida pelos linfócitos TH2 promove a diferenciação em TH2; e a IL-10, também produzida pelas células TH2, inibe a ativação dos linfócitos TH1. Assim, cada subpopulação amplifica o seu clone e inibe o da outra. Por essa razão, uma vez que uma resposta imune se desenvolve ao longo de uma via, ela se torna cada vez mais polarizada naquela direção (Figura 54), e a polarização mais extrema é vista nas infecções crônicas ou na exposição a antígenos ambientais, quando a estimulação imune é persistente.195 Citocina: estabelece a presença de atividade das células TH1.

Receptores dos interferons e ativação da via clássica JAK-STAT
IFNG STAT1 CXCL10, TGTP, CXCL9, LY6C, IGTP, IFI1, IIGP1, SAMHD1, AIF1 e genes do MHC das classes I e II A associação dessas informações com o perfil dos genes selecionados para estudo no transcriptoma do dia 7 permite identificar, nessa fase da pesquisa, evidências de. Uma delas consiste no aumento do mRNA do gene que codifica a CXCL10, que conhecidamente promove a resposta imune celular TH1.197 A outra, muito importante, é o aumento da expressão dos genes induzidos pelo interferon gama: CXCL10,198 TGTP,199 CXCL 9,198,200 LY6C,201 STAT 1,174,202 IGTP,203 IFI1,204 IIGP1,205 SAMHD1,206,207 AIF1208 e os que codificam as moléculas do MHC das classes I e II. Como demonstrado na Figura 56, o interferon gama liga-se a um receptor de membrana denominado receptor de interferon gama, composto de duas subunidades (IFNGR1 e IFNGR2), que se associam à Janus-cinase (JAK) 1 e JAK2, respectivamente. A ativação dessas enzimas resulta em fosforilação do transdutor de sinais e ativador da transcrição -1 (STAT1), com subseqüente formação do homodímero STAT1-STAT1, que se transloca ao núcleo e se liga aos elementos do GAS (IFN-γ-activated site), presentes em genes estimulados pelo interferon, promovendo a transcrição desses genes.174 Aciona a transcrição dos genes induzidos pelos interferons.

Fatores reguladores do interferon (IRF7 e IRF9) Interferon gama
Dia 3 Dia 7 Fatores reguladores do interferon (IRF7 e IRF9) Interferon gama Genes induzidos pelo Ifnγ Via molecular com genes correlacionados Ativação temporal dos indutores do interferon em fases precoces da lesão biliar, seguida da expressão de uma rede molecular dirigida pelo interferon gama, que conhecidamente polariza os linfócitos em um perfil pró-inflamatório TH1. Outras investigações revelaram que na atresia biliar existe infiltrado inflamatório portal, constituído de linfócitos que circundam e invadem os ductos biliares intra-hepáticos,129 com predomínio de células T CD4+,33 T CD8+ T212 ou uma mistura destes dois tipos de linfócitos.37 Davenport et al. avaliaram, por imuno-histoquímica, a árvore biliar remanescente e o tecido hepático de 28 pacientes com AVBEH, tendo como grupo controle o material da biópsia hepática de oito pacientes com outras doenças colestáticas. Observaram predomínio dos linfócitos T CD4+ e das células NK (CD56+) no fígado de pacientes com atresia, no momento da portoenterostomia.34 Mais recentemente, Mack et al. detectaram, por técnicas de imuno-histoquímica, aumento das células de Kupffer (CD68+) e de linfócitos T CD8+ e CD4+ nos espaços porta de pacientes com atresia das vias biliares. A análise pela reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa do tecido hepático demonstrou a presença de um perfil de citocinas característico da presença de linfócitos TH1, a saber: IL-2, interferon gama, TNFα e IL-12. Esse perfil não foi observado nos pacientes sadios, nos portadores de hepatite neonatal ou de cisto de colédoco, estando também presente nos que apresentavam colestase associada ao uso de nutrição parenteral. Os autores realizaram então a hibridização in situ, que revelou que as células produtoras dessas citocinas estavam localizadas nos espaços porta das crianças atrésicas, enquanto naquelas com colestase por NPT tinham distribuição lobular. Esses achados sugerem que o infiltrado inflamatório portal presente nos pacientes portadores de atresia biliar não deve ser apenas uma resposta à colestase, mas pode representar uma reação imune que participa da fisiopatologia da obliteração das vias biliares. Esses resultados, na medida em que demonstram a polarização da resposta imune para células TH137, são consistentes com o resultado do transcriptoma das vias biliares da atual pesquisa.150 O transcriptoma também demonstrou, nas diferentes fases do processo obliterativo, ativação dos genes que estimulam a produção do interferon alfa (IRF7, IRF9), no dia 3, e dos genes que são estimulados por essa citocina (STAT 1, IFI1), no dia 7. Quanto ao papel do interferon alfa na patogênese da atresia, de modo contrário ao interferon gama, cuja administração induziu a AVBEH em camundongos knock out para essa citocina, em pesquisa já citada,36 a administração do interferon alfa preveniu o desenvolvimento da obstrução biliar em camundongos infectados pelo RRV no período neonatal.126 Provavelmente, o interferon alfa atua como droga antiviral nas fases precoces da infecção, interferindo na interação entre o RRV e os colangiócitos ou bloqueando a resposta inflamatória. Dessa forma, é pouco provável que o interferon tipo I (alfa ou beta) desempenhe papel patogênico importante nesse modelo experimental. Em relação à citotoxicidade mediada por células, os linfócitos T CD8+ naive diferenciam-se em CTLs, que reconhecem e eliminam as células-alvo, quando estimuladas pelo antígeno, por co-estimuladores e pelos linfócitos auxiliares. A diferenciação consiste no desenvolvimento de grânulos citoplasmáticos que contêm proteínas, incluindo perforinas e granzimas, cuja função é destruir as outras células. Além disso, os CTLs diferenciados são capazes de secretar citocinas, especialmente o interferon gama e o TNF.195 A expressão do interferon gama já foi discutida anteriormente. Quanto ao TNF, que também teve sua expressão aumentada no transcriptoma do dia 7 (TNFRSF1β, TNFαIP2), é um dos principais mediadores da resposta inflamatória e das complicações sistêmicas das infecções, sendo produzido por fagócitos mononucleares ativados, células T estimuladas por antígenos, células NK e mastócitos. Vale ressaltar que o interferon gama, produzido pelas células T e NK, induz o aumento da síntese do TNF.173 Assim, o aumento da produção do interferon gama pode ter influenciado no aumento da expressão do TNF. Em baixas concentrações, o TNF age sobre os leucócitos e o endotélio para induzir inflamação aguda. Em concentrações moderadas, o TNF medeia os efeitos sistêmicos da inflamação, como a febre e a síntese de proteínas da fase aguda. Quando presente em altos níveis, ocasiona diminuição da contratilidade do miocárdio e vasodilatação, resultando em hipotensão e choque séptico.173

Papel do interferon gama na obstrução das vias biliares
Modelo animal SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary atresia. J. Clin. Invest 114, (2004). MACK, C. L. et al. Armed CD4+ TH1 effector cells and activated macrophages participate in bile duct injury in murine biliary atresia. Clin. Immunol. 115, (2005). Camundongos knock out para essa citocina importância do interferon gama no desenvolvimento da obstrução biliar. Aumento da produção do interferon gama pelos linfócitos TH1 e elevação do TNF-α produzido pelos macrófagos. MACK, C. L. et al. Biliary atresia is associated with CD4+ TH1 cell-mediated portal tract inflammation. Pediatr. Res. 56, (2004). BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of proinflammatory immunity in children with biliary atresia. Lancet 360, (2002). Crianças Outras investigações revelaram que na atresia biliar existe infiltrado inflamatório portal, constituído de linfócitos que circundam e invadem os ductos biliares intra-hepáticos,129 com predomínio de células T CD4+,33 T CD8+ T212 ou uma mistura destes dois tipos de linfócitos.37 Davenport et al. avaliaram, por imuno-histoquímica, a árvore biliar remanescente e o tecido hepático de 28 pacientes com AVBEH, tendo como grupo controle o material da biópsia hepática de oito pacientes com outras doenças colestáticas. Observaram predomínio dos linfócitos T CD4+ e das células NK (CD56+) no fígado de pacientes com atresia, no momento da portoenterostomia.34 Mais recentemente, Mack et al. detectaram, por técnicas de imuno-histoquímica, aumento das células de Kupffer (CD68+) e de linfócitos T CD8+ e CD4+ nos espaços porta de pacientes com atresia das vias biliares. A análise pela reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa do tecido hepático demonstrou a presença de um perfil de citocinas característico da presença de linfócitos TH1, a saber: IL-2, interferon gama, TNFα e IL-12. Esse perfil não foi observado nos pacientes sadios, nos portadores de hepatite neonatal ou de cisto de colédoco, estando também presente nos que apresentavam colestase associada ao uso de nutrição parenteral. Os autores realizaram então a hibridização in situ, que revelou que as células produtoras dessas citocinas estavam localizadas nos espaços porta das crianças atrésicas, enquanto naquelas com colestase por NPT tinham distribuição lobular. Esses achados sugerem que o infiltrado inflamatório portal presente nos pacientes portadores de atresia biliar não deve ser apenas uma resposta à colestase, mas pode representar uma reação imune que participa da fisiopatologia da obliteração das vias biliares. Esses resultados, na medida em que demonstram a polarização da resposta imune para células TH137, são consistentes com o resultado do transcriptoma das vias biliares da atual pesquisa.150 O transcriptoma também demonstrou, nas diferentes fases do processo obliterativo, ativação dos genes que estimulam a produção do interferon alfa (IRF7, IRF9), no dia 3, e dos genes que são estimulados por essa citocina (STAT 1, IFI1), no dia 7. Quanto ao papel do interferon alfa na patogênese da atresia, de modo contrário ao interferon gama, cuja administração induziu a AVBEH em camundongos knock out para essa citocina, em pesquisa já citada,36 a administração do interferon alfa preveniu o desenvolvimento da obstrução biliar em camundongos infectados pelo RRV no período neonatal.126 Provavelmente, o interferon alfa atua como droga antiviral nas fases precoces da infecção, interferindo na interação entre o RRV e os colangiócitos ou bloqueando a resposta inflamatória. Dessa forma, é pouco provável que o interferon tipo I (alfa ou beta) desempenhe papel patogênico importante nesse modelo experimental. Em relação à citotoxicidade mediada por células, os linfócitos T CD8+ naive diferenciam-se em CTLs, que reconhecem e eliminam as células-alvo, quando estimuladas pelo antígeno, por co-estimuladores e pelos linfócitos auxiliares. A diferenciação consiste no desenvolvimento de grânulos citoplasmáticos que contêm proteínas, incluindo perforinas e granzimas, cuja função é destruir as outras células. Além disso, os CTLs diferenciados são capazes de secretar citocinas, especialmente o interferon gama e o TNF.195 A expressão do interferon gama já foi discutida anteriormente. Quanto ao TNF, que também teve sua expressão aumentada no transcriptoma do dia 7 (TNFRSF1β, TNFαIP2), é um dos principais mediadores da resposta inflamatória e das complicações sistêmicas das infecções, sendo produzido por fagócitos mononucleares ativados, células T estimuladas por antígenos, células NK e mastócitos. Vale ressaltar que o interferon gama, produzido pelas células T e NK, induz o aumento da síntese do TNF.173 Assim, o aumento da produção do interferon gama pode ter influenciado no aumento da expressão do TNF. Em baixas concentrações, o TNF age sobre os leucócitos e o endotélio para induzir inflamação aguda. Em concentrações moderadas, o TNF medeia os efeitos sistêmicos da inflamação, como a febre e a síntese de proteínas da fase aguda. Quando presente em altos níveis, ocasiona diminuição da contratilidade do miocárdio e vasodilatação, resultando em hipotensão e choque séptico.173 Perfil de citocinas característico da presença de linfócitos TH1, a saber: IL-2, interferon gama, TNFα e IL-12. Aumento do interferon gama e do osteopontin, sinalizando a resposta TH1, bem como a desativação dos genes relacionados às imunoglobulinas.

Mediador da resposta inflamatória
Transcriptoma: dia 7 IFNG TNFRSF1β, TNFαIP2 Mediador da resposta inflamatória Fagócitos mononucleares ativados, células T estimuladas por antígenos, células NK e mastócitos. Além disso, os CTLs diferenciados são capazes de secretar citocinas, especialmente o interferon gama e o TNF. TNF, que também teve sua expressão aumentada no (TNFRSF1β, TNFαIP2), é um dos principais mediadores da resposta inflamatória e das complicações sistêmicas das infecções, sendo produzido por fagócitos mononucleares ativados, células T estimuladas por antígenos, células NK e mastócitos. Vale ressaltar que o interferon gama, produzido pelas células T e NK, induz o aumento da síntese do TNF.173 Assim, o aumento da produção do interferon gama pode ter influenciado no aumento da expressão do TNF.

Enzima Dia 7

Expressão coordenada de genes co-relacionados
Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos: linfócito T CD4+ Catepsinas Figura 59 - Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos. (A) Captação das proteínas extra-celulares (vesículas endocíticas). (B) Processamento das proteínas no interior das vesículas (endossômicas/lisossômicas), com geração de peptídeos. (C) Biossíntese das moléculas do MHC da classe II e seu transporte para os endossomos. (D) Formação do complexo peptídeo-MHC da classe II e seu transporte em vesículas. (E) Expressão desses complexos na superfície celular. CLIP, peptídeo de cadeia invariante associado à classe II; RE, retículo endoplasmático. Além disso, é importante observar que ocorreu ativação dos genes CTSS e CTSC, que codificam as catepsinas S e C, respectivamente. Essas, por sua vez, desempenham papel relevante na geração de peptídeos para a via MHC da classe II (Figura 59). Nessa via, os antígenos extracelulares são endocitados, e as proteínas interiorizadas são degradadas enzimaticamente nos endossomos e lisossomos até gerar os peptídeos que se ligam a moléculas do MHC da classe II.170 As proteases ácidas são responsáveis pelo processamento do antígeno internalizado e, dessas, a catepsina S, que teve sua expressão aumentada no dia 7, parece ser predominantemente envolvida no processamento de antígenos vesiculares.170 De modo interessante, nessa mesma fase da pesquisa (dia 7), observou-se aumento da expressão do MHCII, sendo mais um exemplo da expressão coordenada de genes co-relacionados. Biossíntese do MHC da classe II CTSC, CTSS H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1 Processamento do antígeno Expressão coordenada de genes co-relacionados

Apoptose Dia 7

Mediadores da apoptose: exocitose de grânulos
GZMA GZMB Mecanismos da apoptose das células-alvo, mediados pelo CTL. (A,B,C,D) Apoptose da célula-alvo mediada por FasL-Fas. (A) Expressão do FasL na superfície da célula efetora e do Fas nas células-alvos. (B) Trimerização do Fas após a formação do complexo Faz-FasL e sua ligação ás proteínas adaptadoras contendo domínios de morte. (C) Ativação da caspase 8, que cliva a caspase 3. (D) A caspase 3 aivada cliva o inibidor do CAD, o qual entra no núcleo e degrada o DNA. (E) Apoptose da célula-alvo mediada pela exocitose de grânulos, com formação de poro na membrana células pela perforina, entrada da granzima na célula-alvo, ativação das caspases e apoptose da célula. CAD: caspase-activated DNAse; I-CAD: inhibitor of caspase activated deoxyribonuclease Papel: CTLs Lise das células-alvo

Mediadores da apoptose: mediada por FasL-Fas
CASP8 dia 7 Ativação das células TH1 (interferon gama) e dos TCLs (granzimas e caspases), e quanto aos processos moleculares, ficou claramente evidenciada a rede pró-inflamatória mediada pelo interferon gama. Mecanismos da apoptose das células-alvo, mediados pelo CTL. (A,B,C,D) Apoptose da célula-alvo mediada por FasL-Fas. (A) Expressão do FasL na superfície da célula efetora e do Fas nas células-alvos. (B) Trimerização do Fas após a formação do complexo Faz-FasL e sua ligação ás proteínas adaptadoras contendo domínios de morte. (C) Ativação da caspase 8, que cliva a caspase 3. (D) A caspase 3 aivada cliva o inibidor do CAD, o qual entra no núcleo e degrada o DNA. (E) Apoptose da célula-alvo mediada pela exocitose de grânulos, com formação de poro na membrana células pela perforina, entrada da granzima na célula-alvo, ativação das caspases e apoptose da célula. CAD: caspase-activated DNAse; I-CAD: inhibitor of caspase activated deoxyribonuclease Apesar das evidências da apoptose terem sido observadas nesta pesquisa com animais, bem como por outros autores nas células dos ductos biliares de crianças com atresia,220 o seu papel no desenvolvimento ou na progressão da obstrução biliar ainda não está estabelecido e deve ser o foco de futuras pesquisas. O principal mecanismo efetor da imunidade mediada pelas células T citotóxicas é a lise das células-alvo, mediada pela exocitose dos grânulos dos CTLs ou pela ligação FasL-Fas.195 A liberação de grânulos líticos dos CTLs ocorre após o reconhecimento de um antígeno em uma célula-alvo. Esses grânulos são lisossomas modificados que contêm duas classes distintas de proteínas efetoras citotóxicas, expressas seletivamente em CTLs, a perforina e as granzimas. Quando uma célula T CD8+ citotóxica reconhece o antígeno, o conteúdo dos grânulos é liberado sobre a célula-alvo. As moléculas de perforina se polimerizam e se inserem na membrana dessa célula, formando poros. As granzimas entram nas células-alvo por esses canais, e a granzima B ativa as enzimas celulares chamadas caspases, as quais clivam vários substratos e induzem a apoptose da célula-alvo (Figura 57). A célula morre também pelo alto influxo de água e cálcio que penetra em seu interior pelos poros.195 O transcriptoma das vias biliares do presente estudo expressou uma ativação temporal, restrita ao dia 07, dos genes relacionados à apoptose, tantos dos que codificam as moléculas que desencadeiam esse processo (granzimas A e B), quanto daqueles que estimulam a produção de proteínas que participam na sinalização da morte celular (caspases 1, 4 e 8). Nesse contexto, Funaki et al. demonstraram que quase 50% das células epiteliais dos ductos biliares intra-hepáticos de pacientes atrésicos encontram-se apoptóticas, em contraste com apenas 2,5% a 3,6% no grupo controle.219 De modo diferente, Ahmed et al. demonstraram a presença de linfócitos T CD8+ e de seus marcadores [perforina, granzima B, FasL (CD95L)] em 47 casos de atresia biliar operados com 12 a 79 dias de vida. Os resultados foram comparados com os de pacientes portadores de cirrose biliar primária (CBP). Na atresia, o infiltrado por células T CD8+ foi similar ao observado na CBP. Entretanto, em contraste com esta, não foi observada a presença de marcadores citotóxicos, como perforina, granzima ou FasL, nas células do infiltrado inflamatório dos ductos biliares de pacientes atrésicos.212 A outra via de morte celular é desencadeada pelo FasL, uma proteína de membrana que pertence à família do TNF, expressa predominantemente nas células T ativadas (CD8+ e TH1), monócitos e macrófagos, que se acopla ao Fas na superfície da célula-alvo e induz à apoptose. A ligação do FasL ocasiona a trimerização do Fas, o qual se liga às proteínas adaptadoras que contêm domínios da morte. Estas recrutam e ativam a caspase 8,193 cuja expressão foi aumentada no transcriptoma do dia 7, que cliva a caspase 3. A ativação desta libera a DNase ativada por caspase (CAD), que entra no núcleo e cliva o DNA (Figura 57).193 Liu et al., em pesquisa que teve como objetivo investigar o papel do Fas e de seu ligante (FasL) na atresia biliar, observaram que a expressão do FasL no epitélio do ducto biliar se associou a pior prognóstico após a portoenterostomia.220 Esta pode ser uma evidência de que a expressão do FasL no epitélio dos ductos biliares pode participar da lesão progressiva dos ductos biliares intra-hepáticos após a portoenterostomia. Expressão do FasL no epitélio dos ductos biliares pode participar da lesão progressiva dos ductos biliares intra-hepáticos após a portoenterostomia. LIU, C. et al. Expression of fas ligand on bile ductule epithelium in biliary atresia--a poor prognostic factor. J. Pediatr. Surg. 35, (2000).

Histologia das VBEH X transcriptoma biliar

Imunidade Dia 14

Ativação: Metabolismo do ferro
HAMP1 Maior ativação gênica LCN2 Diminuem a disponibilidade de ferro e, por isso, além de agirem como fatores de defesa, também podem ser responsáveis pela anemia da inflamação ou doença. Desativação: Recrutamento de linfócitos CCL21A Dos genes ativados, chama atenção a intensa ativação dos relacionados ao metabolismo do ferro, o HAMP1 e o LCN2. A expressão do gene HAMP1, produzido pelos hepatócitos e estimulado pela interleucina 6,213 foi 116,6 vezes maior nos camundongos atrésicos em relação ao grupo controle, constituindo a maior ativação gênica das três fases da pesquisa (dias 3, 7 e 14); e o LCN2 foi ativado 41 vezes acima do controle. Ambos atuam diminuindo a disponibilidade de ferro e, por isso, além de agirem como fatores de defesa, também podem ser responsáveis pela anemia da inflamação ou doença crônica.213,214 Dessa forma, podem ter contribuído para a piora clínica progressiva dos camundongos. Outro gene ativado foi o CD14, que participa da ativação de macrófagos na imunidade inata215 e cujo aumento de expressão também foi evidenciado em pesquisa que avaliou o transcriptoma hepático após a ligadura dos ductos biliares em camundongos adultos.216 Assim, o aumento da expressão desse gene pode representar uma resposta geral ao impedimento do fluxo biliar, ao invés de constituir uma resposta específica do modelo experimental da atresia. No transcriptoma do dia 14, além da diminuição acentuada do número de genes da imunidade ativados, observou-se a desativação dos genes CCL21A e VAP1, que influenciam no recrutamento de linfócitos.217,218 O CCL21, gene que apresentou maior grau de desativação no dia 14 (imunidade), é um ligante para o CCR7, que desempenha papel vital na migração de linfócitos e das células dendríticas para dentro da zona de células T dos linfonodos.217 Assim, o CCL21 tem papel essencial no recrutamento de células T efetoras para tecidos periféricos, e seu silenciamento pode ter contribuído para a diminuição do processo imune no dia 14. Menor número de genes da imunidade: 17 (14%). 8 (47%) estavam silenciados. VAP1 Silenciamento: diminuição dos processos imunes no dia 14

Transdução de sinais Dia 14

Silenciamento de genes
Transdução de sinais relacionados à imunidade

Fatores de transcrição das células T
Figura 61 - Fatores de transcrição das células T. (A) Sinalização mediada pelo TCR. (B) Reações bioquímicas intermediárias. (C) Enzimas de sinalização. (D) Fatores de transcrição. TCR: receptor de célula T.

Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T
MAP2K5 RHOB JUN Figura 60 - Eventos da sinalização intra-celular para ativação dos fatores de transcrição nas células T. A estimulação das células T por antígenos desencadeia várias vias de sinalização, que finalizam no núcleo, onde os fatores de transcrição estimulam a expressão de genes responsáveis pelas respostas das células T ativadas, como a interleucina 2. De modo diferente do dia 7, o transcriptoma do dia 14 evidenciou o silenciamento de genes que apresentam importante atuação na transdução de sinais relacionados à imunidade. O gene RHOB, desativado nessa etapa da pesquisa, codifica uma proteína Ras, membro de uma família de proteínas ligadoras de nucleotídeos (guanina), de 21 kD (pequena proteína G), com atividade GTPase intrínseca, que participa em muitas vias de transdução de sinais, em vários tipos de células. Na ativação das células T, a proteína Ras é recrutada para a membrana plasmática, onde é ativada por fatores de troca de GDP-GTP. A seguir, a GTP Ras inicia a cascata de cinases MAP, que induzem à transcrição do gene fos e à montagem do fator de transcrição AP-1.189 De modo coordenado, a expressão do gene JUN, fator de transcrição para a subunidade da proteína AP-1, também estava diminuída. Essa proteína, composta de dímeros de duas proteínas que se unem entre si por meio de uma forma estrutural compartilhada chamada zíper de leucina, é membro da família dos fatores de transcrição. O fator da AP-1 mais bem caracterizado é composto das proteínas Fos e Jun, cujo gene codificante foi silenciado no dia 14. A AP-1 está envolvida na regulação transcricional de muitos genes importantes no sistema imunológico, como os genes que codificam a produção de citocinas.189 A desativação da proteína cinase ativada por mitógeno (MAP cinase), detectada pelos baixos níveis de expressão do gene MAP2K5 nesse transcriptoma, também faz parte desse sistema coordenado de sinais de transdução. Uma vez ativadas, as proteínas G pequenas ativam a cascata das MAP cinases, ocasionando diretamente à fosforilação e à ativação de fatores de transcrição no núcleo. A família de fatores de transcrição AP-1, por exemplo, é ativada pela cascata das MAP cinases.189 Assim, o transcriptoma do dia 14 demonstra mais uma via molecular coordenada por genes co-relacionados, que induzem, dessa vez, a desativação das vias responsáveis pela produção da AP-1, um dos três fatores de transcrição que são ativados nas células T pelo reconhecimento do antígeno, críticos para a maioria das respostas das células T (Figura 60), como a produção da interleucina 2. Os dois outros são o fator nuclear das células T ativadas (NFAT) e o fator nuclear kB (NF-kB).189

Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T
FKBP5 O NFAT é ativado pela fosfatase calcineurina dependente do cálcio-calmodulina. A calcineurina desfosforila o NFAT citoplasmático, expondo um sinal de localização nuclear que permite ao NFAT translocar-se para o núcleo. Uma vez no núcleo, liga-se a regiões reguladoras dos genes das citocinas como da IL-2, da IL-4 e do TNF, em geral associado a outros fatores de transcrição como a AP De modo interessante, um dos seis genes ativados nessa fase da pesquisa foi o FKBP5, que inibe a calcineurina e tem efeito imunossupressor. Na verdade, o mecanismo de ativação do NFAT foi descoberto indiretamente, por estudos sobre o mecanismo de ação das drogas imunossupressoras, como o FK-506, que se liga a uma proteína estruturalmente homóloga, chamada proteína de ligação ao FK (FKBP),189 cujo gene codificante teve sua expressão aumentada no transcriptoma do dia 14. O complexo FK-506-FKBP inibe a calcineurina e, conseqüentemente, bloqueia a translocação do NFAT para o núcleo.189 Dessa forma, a ativação do gene FKBP5, no dia 14, atua inibindo um segundo fator de transcrição das células T, o NFAT. O terceiro fator de transcrição é o NF-κB, essencial para a síntese de citocinas. Nas células T em repouso, esse fator está presente no citoplasma associado a proteínas inibitórias, denominadas IκBs, que bloqueiam a sua entrada no núcleo. Durante a ativação dos linfócitos, os sinais emitidos pelo TCR induzem a fosforilação das serinas dos IκBs pela proteína cinase C (PKC) e pela via MAP cinase. A fosforilação do IκB, seguida de sua ubiquinização e destruição nos proteossomos, libera o NF-κB, que se transloca para o núcleo, onde ativa a transcrição dos genes que codificam as citocinas e seus receptores.189 No transcriptoma do dia 14, foi observada desativação da MAP cinase e de outras cinases que podem influenciar na expressão do NF-κB.189 Entretanto, não observamos evidências diretas de sua ativação ou silenciamento. Nesse contexto, recentemente, Feng et al. observaram que os animais que desenvolveram atresia biliar após a inoculação do RRV apresentaram níveis elevados de NF-κB ativo no fígado e nos ductos biliares extra-hepáticos e, de modo interessante, a inibição química desse fator preveniu a obstrução biliar secundária ao RRV. Esses autores sugerem que a obliteração das vias biliares induzida pelo RRV é mediada pela forma ativa do NF-κB.242 Levando-se em consideração que o NF-κB desempenha importante papel na defesa imune, por induzir a transcrição de vários genes e estimular o desenvolvimento e a sobrevida das células T em vários estágios,243 os resultados obtidos por Feng et al. são consistentes com o importante papel da imunidade na fisiopatologia da atresia, embora não definam os níveis das diferentes citocinas, nas duas situações da pesquisa: presença ou ausência da forma ativa do NF-κB. Neste aspecto, é importante lembrar que o NF-κB regula a expressão de muito genes relacionados à resposta inflamatória/imune e que pode atuar em sinergismo com o STAT1, que como já mencionado é estimulado e participa na via de sinalização da resposta aos interferons.244 Outros genes também estão desativados nesta fase da pesquisa, alguns ligados ao metabolismo (como o ADIPOQ, que atua no metabolismo de glicose e lipídios)245 mas que, provavelmente, não participam da patogênese da obstrução biliar. Resumindo, os sinais de transdução evidenciados no transcriptoma do dia 14 atuaram no sentido de silenciar importantes eventos de sinalização intracelular da célula T, como demonstrado na Figura 61.

Sinergismo com o STAT1: sinalização da resposta aos interferons.
Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T O terceiro fator de transcrição é o NF-κB, essencial para a síntese de citocinas. Nas células T em repouso, esse fator está presente no citoplasma associado a proteínas inibitórias, denominadas IκBs, que bloqueiam a sua entrada no núcleo. Durante a ativação dos linfócitos, os sinais emitidos pelo TCR induzem a fosforilação das serinas dos IκBs pela proteína cinase C (PKC) e pela via MAP cinase. A fosforilação do IκB, seguida de sua ubiquinização e destruição nos proteossomos, libera o NF-κB, que se transloca para o núcleo, onde ativa a transcrição dos genes que codificam as citocinas e seus receptores.189 No transcriptoma do dia 14, foi observada desativação da MAP cinase e de outras cinases que podem influenciar na expressão do NF-κB.189 Entretanto, não observamos evidências diretas de sua ativação ou silenciamento. Nesse contexto, recentemente, Feng et al. observaram que os animais que desenvolveram atresia biliar após a inoculação do RRV apresentaram níveis elevados de NF-κB ativo no fígado e nos ductos biliares extra-hepáticos e, de modo interessante, a inibição química desse fator preveniu a obstrução biliar secundária ao RRV. Esses autores sugerem que a obliteração das vias biliares induzida pelo RRV é mediada pela forma ativa do NF-κB.242 Levando-se em consideração que o NF-κB desempenha importante papel na defesa imune, por induzir a transcrição de vários genes e estimular o desenvolvimento e a sobrevida das células T em vários estágios,243 os resultados obtidos por Feng et al. são consistentes com o importante papel da imunidade na fisiopatologia da atresia, embora não definam os níveis das diferentes citocinas, nas duas situações da pesquisa: presença ou ausência da forma ativa do NF-κB. Neste aspecto, é importante lembrar que o NF-κB regula a expressão de muito genes relacionados à resposta inflamatória/imune e que pode atuar em sinergismo com o STAT1, que como já mencionado é estimulado e participa na via de sinalização da resposta aos interferons.244 Outros genes também estão desativados nesta fase da pesquisa, alguns ligados ao metabolismo (como o ADIPOQ, que atua no metabolismo de glicose e lipídios)245 mas que, provavelmente, não participam da patogênese da obstrução biliar. Resumindo, os sinais de transdução evidenciados no transcriptoma do dia 14 atuaram no sentido de silenciar importantes eventos de sinalização intracelular da célula T, como demonstrado na Figura 61. NF-κB regula a expressão de muito genes relacionados à resposta inflamatória/imune. Sinergismo com o STAT1: sinalização da resposta aos interferons. Inibição química desse fator: preveniu a obstrução biliar secundária ao RRV. FENG, J. et al. Rotavirus-induced murine biliary atresia is mediated by nuclear factor-kappaB. J. Pediatr. Surg. 40, (2005).

Via molecular coordenada por genes co-relacionados:
Desativação das vias responsáveis: Produção do AP-1 Ativação do NFAT Via molecular coordenada por genes co-relacionados Desativação das vias responsáveis pela produção da AP-1, um dos três fatores de transcrição que são ativados nas células T pelo reconhecimento do antígeno, críticos para a maioria das respostas das células T (Figura 60), como a produção da interleucina 2. Os dois outros são o fator nuclear das células T ativadas (NFAT) e o fator nuclear kB (NF-kB).189

Proteínas estruturais

Microscópio de captura a laser de alta resolução.
Desativados Matriz extracelular Dia 7: FBN2, ADAMTS5, COL4A5, COL14A1, PCOLCE, SPARCL1, FGFR1, GSN, MFAP2, OGN Dia 14: COL4A5, COL16A1, FBLN1, FMOD, FLRT3 Alta expressão: “morfogênese, fibrinogênese e remodelamento da matriz extracelular”. CHEN, L. et al. Altered expression of genes involved in hepatic morphogenesis and fibrogenesis are identified by cDNA microarray analysis in biliary atresia. Hepatology 38, (2003). CHOE, B. H. et al. The pattern of differentially expressed genes in biliary atresia. J. Korean Med. Sci. 18, (2003). Em relação às proteínas estruturais, no dia 3, foram expressos genes relacionados aos constituintes do citoesqueleto (ARPC3), às proteínas da junção intercelular epitelial (CLDN7) e ao componente da matriz extracelular (COL12A1), mas a avaliação global dos genes listados na Tabela 15 não evidencia a presença de uma via molecular específica, que poderia estar participando na patogênese da atresia. Nos dias 3 e 7, foram selecionados genes que também codificam proteínas que participam de processos imunes, como a coronina (CORO1A), uma proteína que se liga à actina e que influencia na quimiotaxia, na fagocitose e na diferenciação das células T.232 Quanto aos genes desativados, destacam-se os relacionados à matriz extracelular, silenciados no dia 7 (FBN2, ADAMTS5, COL4A5, COL14A1, PCOLCE, SPARCL1, FGFR1, GSN, MFAP2, OGN), bem como no dia 14 (COL4A5, COL16A1, FBLN1, FMOD, FLRT3). Como na AVBEH ocorre uma obliteração fibrosante progressiva das vias biliares, esses resultados não eram esperados. De modo diferente, Chen et al., em estudo com microarranjos que avaliou a expressão gênica no tecido hepático de pacientes portadores de atresia biliar no momento do transplante, tendo como grupo controle pacientes sadios e portadores de outras doenças colestáticas, observaram alta expressão dos genes classificados funcionalmente na classe da “morfogênese, fibrinogênese e remodelamento da matriz extracelular”, isto é, aqueles que codificam componentes estruturais ou modificadores da matriz extracelular.233 Outro estudo semelhante, realizado por Choe et al., demonstrou aumento da expressão de genes associados com a fibrose hepática. 234 Esses dois grupos de pesquisadores avaliaram pacientes em estágio avançado da doença, no momento do transplante, o que pode ter contribuído para os resultados. Entretanto, mesmo considerando que os animais da atual pesquisa foram sacrificados até 14 dias após a inoculação do RRV, quando ainda não havia cirrose hepática instalada, era esperado que o transcriptoma revelasse um aumento da expressão dos genes relacionados à deposição do colágeno e à matriz extracelular, o que não foi observado. O silenciamento dos genes que regulam a produção ou o remodelamento da matriz extracelular pode ter sido decorrente da pequena quantidade de células viáveis nas fases tardias da obstrução biliar. Além disso, pode ter ocorrido a exclusão de segmentos atrésicos durante a ressecção da árvore biliar extra-hepática. A microdissecção das vias biliares circundadas por tecido pancreático e mesentérico de camundongos no período neonatal, realizada neste estudo,150 constitui um desafio técnico, mesmo quando utilizado microscópio de dissecção. Para solucionar esse problema, em futuras análises deverá ser utilizado microscópio de captura a laser de alta resolução, instrumento capaz de possibilitar a seleção de segmentos atrésicos.235 Ainda nesse contexto, Lee et al., estudando pacientes portadores de atresia no momento da cirurgia de Kasai ou do transplante hepático, observaram que o aumento da expressão do TGF β2 (Transforming growth factor β 2) associa-se à progressão da doença e à fibrose.236 Os TGF β1 e β2 e seus receptores são potentes mediadores da fibrose,237 e os transcriptomas dos dias 7 e 14 demonstraram desativação do gene LTBP4 (Latent transforming growth factor beta binding protein 4). Os comentários citados anteriormente podem justificar a diferença entre esses resultados. Além disso, e de modo curioso, no dia 3 o gene VIL2 e no dia 14 o gene SVIL estavam desativados. Sabe-se que a secreção biliar requer o transporte de solutos orgânicos e inorgânicos do sangue e dos sinusóides para os canalículos biliares e que a villin é uma proteína do citoesqueleto, necessária para a manutenção e a integridade das microvilosidades do bordo estriado das células epiteliais canaliculares, nas quais os transportadores de membrana da secreção biliar estão localizados. Phillips et al. observaram que a expressão do gene VIL estava reduzida ou ausente nas crianças portadoras de doenças hepáticas colestáticas progressivas e sugeriram que esse gene pode desempenhar papel importante nesse tipo de doença.238 A contribuição de seu silenciamento na progressão da colestase no modelo animal utilizado nesta pesquisa ainda não foi estabelecida. Pequena quantidade de células viáveis nas fases tardias da obstrução biliar. Exclusão de segmentos atrésicos durante a ressecção da árvore biliar extra-hepática. Microscópio de captura a laser de alta resolução.

Validação dos resultados dos microarranjos pela RT PCR

Curva standard: expressão gênica
Curva standard do gene Irf9

RT PCR: curva de dissociação
Curva de amplificação do gene Stat1, das 18 amostras

Genes escolhidos para validação dos resultados dos microarranjos:
Resultados do RT PCR Genes escolhidos para validação dos resultados dos microarranjos: IRF7, IRF9, IFNG, IGTP, STAT1, CXCL9 e CXCL10 Etapa Gene Descrição Variação* Dia 3 IRF7 Interferon regulatory factor 7 45,2 IRF9 Interferon dependent positive acting transcription factor 3 gamma 7,0 Dia 7 IGTP Interferon gamma induced GTPase 35,3 STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1 12,7 CXCL10 Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 63,5 CXCL9 Chemokine (C-X-C motif) ligand 9 57,4 IFNG Interferon gamma 69,1 Atualmente, a tecnologia dos microarranjos de oligonucleotídeos é o ensaio mais utilizado para avaliação do transcriptoma, pois permite quantificar a expressão de milhares de genes simultaneamente. Além disso, propicia a comparação entre os grupos experimental e controle, entre os genes de uma mesma amostra, bem como durante as diferentes fases da doença, dados que foram analisados no presente estudo. Contudo, apesar da excelência desse teste, é importante que os resultados sejam validados por técnicas de maior acurácia, como a RT PCR.132 Nesta pesquisa,150 os transcriptomas das vias biliares extra-hepáticas das diferentes fases do processo de obstrução biliar demonstraram a presença de um circuito pró-inflamatório e a expressão seqüencial de genes que refletem o predomínio da resposta TH1 e a via molecular do interferon gama. Entretanto, o próprio gene que codifica o interferon gama não foi selecionado em nenhuma das fases da pesquisa (dias 3, 7 e 14). Isso demonstra que os microarranjos são excelentes testes para a geração de hipóteses, pois proporcionam uma visão geral dos processos metabólicos que estão ocorrendo e identificam genes-alvos para pesquisas posteriores, mas a falha na identificação de alguns genes, inclusive daqueles com alto nível de ativação, pode ocorrer. Mesmo os genes que representam a “assinatura” principal do processo biológico podem não ser selecionados, o que não necessariamente representa um problema, pois o objetivo é desvendar as vias moleculares que regulam os processos biológicos. Assim, mesmo que um gene não seja revelado, se a amostra foi bem preparada e não houve contaminação com outros tecidos, esses processos são revelados no transcriptoma e a confirmação da hipótese pode ser feita por métodos mais sensíveis, como a RT PCR. Dessa forma, os genes escolhidos para validação pela RT PCR, nesta pesquisa, relacionam-se ao circuito inflamatório que reflete a via molecular do interferon gama, pois se as amostras foram bem preparadas, se o critério de seleção de genes foi adequado e, especialmente, se o interferon gama participa da patogênese da AVBEH, espera-se que o aumento de expressão dessa citocina seja constatado pela RT PCR, da mesma forma que o aumento da expressão dos genes que fazem parte desse circuito: os que induzem ou são induzidos pelo interferon gama. Confirmando a presença desse importante circuito inflamatório, do qual participa o interferon gama, a RT PCR demonstrou ativação do gene que codifica essa citocina (IFNG), no dia 7. Além disso, confirmou o aumento da expressão dos fatores reguladores de interferon (IRF7 e IRF9), no dia 3, e a ativação dos genes induzidos pelo interferon gama (IGTP, STAT1, CXCL9 e CXCL10), no dia 7. Entretanto, apesar da concordância desses dois testes em relação à ativação dos genes (IRF7, IRF9, IGTP, STAT1, CXCL9 e CXCL10), houve diferenças no grau de ativação, conforme demonstrado na Tabela 31.

Diferença no grau de ativação:
Quantificação da expressão gênica nos microrarranjos e na RT PCR Variação IRF7 (Dia 3) IRF9 IFNG (Dia 7) IGTP STAT1 CXCL9 CXCL10 GeneChip 13 4.1 3.9 12.2 12.5 24.7 36.8 RT PCR 45.2 7.0 69.1 35.3 12.7 57.4 63.5 Diferença no grau de ativação: A RT PCR apresenta maior acurácia e sensibilidade em relação aos microarranjos de oligonucleotídeos, tendo também maior reprodutibilidade. DING, C. & CANTOR, C. R. Quantitative analysis of nucleic acids--the last few years of progress. J. Biochem. Mol. Biol. 37, 1-10 (2004). Resultados da RT PCR Validam os obtidos nos microarranjos (GeneChip®) Confirmam a existência do circuito inflamatório associado ao interferon gama. Polarização para a resposta imune adquirida TH1.

Especificidade dos microarrranjos
33,1 Para o estudo da expressão gênica é muito importante obter amostras homogêneas para extração do RNA, isto é, contendo apenas as células ou os tecidos que se programa avaliar. Se houver contaminação da amostra com outros tecidos, o transcriptoma revelará o padrão de expressão dos genes em tecidos que não constituem o foco da pesquisa, o que compromete os resultados desta de modo irreparável. No estudo atual, a extração da árvore biliar extra-hepática foi realizada por microdissecção, o que permitiu a sua ressecção evitando-se a inclusão de tecido pancreático, hepático ou do mesentério. Além disso, o nível da expressão da citoqueratina-7 (KRT2-7), um filamento presente nos colangiócitos,36 foi elevado nas amostras das vias biliares dos camundongos e praticamente indetectável no tecido hepático, comprovando que as amostras avaliadas correspondiam às vias biliares. 1,2 Fígado Vias biliares *Citoqueratina-7 (KRT2-7): filamento presente nos colangiócitos

Em resumo...

Histologia das VBEH X transcriptoma biliar
Figura 62 - Cortes histológicos transversais das vias biliares extra-hepáticas dos animais infectados pelo RRV associado ao perfil de expressão gênica. Nota-se infiltrado inflamatório leve no dia 3 e pronunciada colangite no dia 7. De modo correlacionado às alterações histológicas, observa-se um padrão temporal de ativação de genes, com elevação dos fatores reguladores do interferon, no dia 3 (IRF7 e IRF9), seguido do aumento da expressão do interferon gama e dos genes induzidos por este, no dia 7. Barra preta: 10 μm. Seqüencialmente, o transcriptoma do dia 14 demonstrou desativação significativa de genes associados a diferentes processos biológicos, inclusive da imunidade, época em que a secção transversal das vias biliares exibiu obliteração dessas por deposição da matriz extra-celular e acúmulo de células inflamatórias. De modo interessante e consistente com a expressão dos genes no dia 14, o infiltrado inflamatório das vias biliares, nesta fase da pesquisa, apresentou menor intensidade em relação ao observado no dia 7. Papel do sistema imune Interferon gama, TH1 Lesão e na obstrução das vias biliares Alvos de intervenção terapêutica?

Aumento da expressão do MHC da classe I
Fase precoce Aumento da expressão do MHC da classe I Moléculas: processamento de antígeno para MHC da classe I Fase tardia Aumento da expressão do MHC da classe II Moléculas: processamento de antígeno para MHC da classe II Moléculas: sinapse imunológica

Ativação da cascata do complemento
Novos achados Apoptose Ativação da cascata do complemento Citotoxicidade mediada por anticorpos

VI - Conclusões

O transcriptoma da árvore biliar demonstrou a presença predominante de um processo pró-inflamatório, neste modelo experimental da atresia de vias biliares extra-hepáticas, com ativação reacional de genes em períodos específicos da progressão do processo obliterativo. Notavelmente, os animais portadores de AVBEH apresentaram ativação do interferon gama e a expressão seqüêncial de uma rede hierárquica de genes relacionados à essa citocina, o que reflete um predomínio da resposta TH1.

A ativação de outros processos biológicos relacionados à apoptose, à cascata de complemento, à ADCC e aos fatores epigenéticos demonstra a presença dessas vias metabólicas durante o desenvolvimento da doença. Coletivamente, esses genes formam uma seleção transcricional altamente importante para a direção de estudos futuros, que possam explorar como genes individuais ou grupo de genes relacionados entre si podem regular o início da lesão biliar, bem como a progressão para obliteração das vias biliares. A definição dos papéis de cada componente desse circuito inflamatório deve contribuir para a elucidação dos mecanismos etiopatogênicos da AVBEH e para o advento de novas opções terapêuticas que influenciem na evolução da doença, no prognóstico do paciente e na necessidade do transplante hepático.

Pranavkumar Shivakumar
Autores Elisa de Carvalho Cong Liu Pranavkumar Shivakumar Gregg Sabla Bruce Aronow Jorge A. Bezerra

Obrigada! Se consegui enxergar mais longe
é porque estava apoiado sobre os ombros de gigantes. Isaac Newton, Matemático Inglês. Obrigada!

Processos imunes – Enzimas – Dia 7
 USP18: imunidade inata.  SLFN4: crescimento e desenvolvimento das células T.  OASL2, OAS1G e OAS2: atividade antiviral, induzida pelos interferons.  GBP1, GBP2 e GBP3: proteína ligadora de GTP com atividade GTPase, induzida pelo interferon gama durante ativação macrofágica.  GZMA: apoptose.  PSMB8, PSMB9 e PSMB10: processamento de antígeno para o MHC da classe I.  SAMHD1: induzida pelo interferon, proteína de ligação ao GTP.  CTSS e CTSC: proteólise, processamento do antígeno e geração de peptídeo para o MHC da classe II.  CYBB, CYP1B1, CYBA, NCF1 e NCF2: complexo NADPH oxidase (fagocitose).  PLA2G7: ativa os neutrófilos polimorfonucleares e aumenta a permeabilidade vascular. Atua na inflamação e na anafilaxia. Produzido por plaquetas, leucócitos e células endoteliais.  HCK: membro da família Src da tirosina cinase, exerce papel na resposta imune inata e na sinalização para ativação do STAT 5.  PTPRC (CD45R): pertence à família dos receptores da tirosina fosfatase, que desempenha papel na sinalização dos receptores dos linfócitos B e T.  LYZS: tem função bacteriolítica, em tecidos e fluidos corporais.  PTPN18: fosforilação de aminoácidos. Desfosforila a autofosforilada tirosina cinase.

Papel da colestase: lesão histológica hepática
Ácidos biliares hidrofóbicos Quanto ao papel da colestase na progressão da doença, o acúmulo de cobre e dos sais biliares tóxicos pode contribuir para a lesão hepática progressiva nos pacientes portadores de colestase crônica. Além disso, existem evidências convincentes de que os ácidos biliares hidrofóbicos podem induzir a apoptose primária de hepatócitos.159 A elevação desses ocasiona alterações da membrana mitocondrial que interferem na sua respiração, despolarização e homeostase do cálcio, culminando com a apoptose e a necrose celular. Além de induzir a apoptose por meio das alterações mitocondriais, os ácidos biliares podem induzi-la diretamente, por se ligarem ao receptor de morte celular,160 como ilustrado na Figura 48. Apoptose primária de hepatócitos PALMEIRA, C. M. & ROLO, A. P. Mitochondrially-mediated toxicity of bile acids. Toxicology 203, 1-15 (2004).

Avaliação do comitê de ética médica
Institutional Animal Care and Use Committee of Cincinnati Children’s Hospital Research Foundation.

Transporte Dia 3

Ativados Transportadores de membrana (ATP8A1 e LAPTM4A)
Transportadores nucleares (XPO7 e NUTF2) Metabolismo (STARD4) Imunidade (TAP2) Transporte de ânions (SLC4A2) Transporte de cátions (ATP6V1B2) Desativados Transporte de colesterol (APOB) Transporte de aminoácidos (SLC1A4)

Controle da transcrição e da tradução
Dia 14

Desativados  Tradução e síntese protéica: EIF4A2, SERPINH1
Fatores de transcrição: TCF21, MEIS1, PBX1, ZF, CEBPG, ZBTB20, JUN  Splicing do RNA: SFRS7  Tradução e síntese protéica: EIF4A2, SERPINH1 De modo similar ao do dia 3 Expressão gênica De modo contrário ao do dia 3 e coordenado com o transcriptoma do dia 14 relacionado à transdução de sinais, os genes selecionados estavam desativados, como os listados a seguir:  Fatores de transcrição: TCF21, MEIS1, PBX1, ZF, CEBPG, ZBTB20, JUN;  Splicing do RNA: SFRS7;  Tradução e síntese protéica: EIF4A2, SERPINH1.227,249 Um dos fatores que pode contribuir para a diminuição da expressão de vários genes no dia 14 é o agravamento progressivo do quadro clínico do animal, que pasa a apresentar intensa fraqueza. Como relatado por outros autores, o óbito dos animais ocorre logo após esta idade.36,154

Extração: RNA das vias biliares RNA
Homogeneização e lise celular (TRIzol) Fase da separação (fenol/clorofórmio) RNA Lipídeos Carboidratos Proteínas Precipitação (isopropanol) RNA RNA TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA

(transcriptase reversa)
Obtenção do cDNA de fita dupla 2,5 μg de RNA Tampão DNase I Água Destruição do DNA Temperatura ambiente (15 min) EDTA 25mM – 65°C (10 min) Desativa a DNase Primers Nucleotídeos Mistura: anelamento RNase OUTTM Anelamento Desfaz estruturas secundárias: RNA 70°C (10 min) - 4°C (1 min) SuperScriptTM (transcriptase reversa) Tampão Agentes redutores 42°C (50 min) - 17°C (15 min) - 4°C (1 min) Formação do cDNA Destruição do RNA SupserScriptTM Reverse Transcriptase (Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA)

RT PCR: Curva padrão  Amostra padrão (conhecida)
Coeficiente de correlação: 1.000  Amostra em estudo (concentração desconhecida)

RT PCR: Curva de dissociação

Controle da quantidade e da qualidade do RNA
Beckman – DU® – 64 – Spectophotometer: Concentração do RNA (A260 x 4): > 2,5 μg Beckman – DU® – 64 – Spectophotometer: Pureza (260/280 nm): razão > 1,6 Agilent 2100 Bioanalyzer Qualidade do RNA

Enzima Dia 3

Degradação do RNA viral
Processos imunes OAS1G e OASL2 Enzima 2’-5’ oligoadenilato sintetase: marcador da atividade dos interferons Degradação do RNA viral Expressão gênica Transcrição: ATF5 HRMT1L2 (transcrição do STAT1) Chaperona: PDIA3 Ciclo da ubiquitina: USP1 e USP7 O transcriptoma das vias biliares do dia 3 revelou aumento da expressão de genes que codificam enzimas relacionadas aos processos imunes, aos mecanismos envolvidos na expressão gênica (transcrição e tradução) e ao metabolismo. Quanto aos relacionados aos processos imunes, merece destaque o aumento da expressão dos genes OAS1G e OASL2 que codificam a enzima 2’-5’ oligoadenilato sintetase, induzida pelos interferons. Essa enzima é considerada um marcador da atividade dos interferons e polimeriza o ATP em uma série de oligômeros com ligações 2’-5’ (os nucleotídeos nos ácidos nucléicos normalmente apresentam ligações 3’-5’). Estes ativam uma endorribonuclease que então degrada o RNA viral.182 Além disso, observou-se ativação de genes relacionados às enzimas que desempenham papel na imunidade inata (USP18),169 no processamento de antígenos (PSMB8)221 e na transdução de sinais, como os genes que codificam a proteína cinase C subfamília de serina/treonina (PRKCN) e a proteína ligadora de GTP com atividade GTPase (GBP3).193 Outro aspecto importante foi o aumento da expressão de genes que codificam enzimas que participam dos mecanismos envolvidos na expressão gênica, como ATF5 (transcrição),222 PDIA3 (chaperone)223 e USP1 e USP7 (ciclo da ubiquitina).224,225 Ademais, houve aumento da expressão do gene HRMT1L2 que atua na transcrição do STAT Esse, como já mencionado anteriormente, é um importante sinal de transdução na resposta aos interferons I e II, o que destaca, mais uma vez, o papel da imunidade. Foram também ativados genes relacionados ao metabolismo de carboidratos (glicogênio) e dos lipídios, como o PYGB e o LIP1, respectivamente.227 Metabolismo Carboidratos (glicogênio): PYGB Lipídios: LIP1

Enzima Dia 7

Receptores do interferon I e ativação da via GAS
HCK Membro da família Src Ativação do STAT5

Enzima Dia 14

Ativado: GSTA2 Demonstrado previamente em análise de expressão de genes em fígado de camundongos adultos submetidos à obstrução crônica dos ductos biliares extra-hepáticos. CAMPBELL, K. M. et al. Transcriptional reprogramming in murine liver defines the physiologic consequences of biliary obstruction. J. Hepatol. 40, (2004). Resposta da colestase crônica ou do estresse oxidativo persistente em estágios avançados da obstrução ao fluxo biliar.

Proteínas estruturais

Desativados VIL2 (dia 3) SVIL (dia 14)
Proteína do citoesqueleto, necessária para a manutenção e a integridade das microvilosidades do bordo estriado das células epiteliais canaliculares, nas quais os transportadores de membrana da secreção biliar estão localizados. Em relação às proteínas estruturais, no dia 3, foram expressos genes relacionados aos constituintes do citoesqueleto (ARPC3), às proteínas da junção intercelular epitelial (CLDN7) e ao componente da matriz extracelular (COL12A1), mas a avaliação global dos genes listados na Tabela 15 não evidencia a presença de uma via molecular específica, que poderia estar participando na patogênese da atresia. Nos dias 3 e 7, foram selecionados genes que também codificam proteínas que participam de processos imunes, como a coronina (CORO1A), uma proteína que se liga à actina e que influencia na quimiotaxia, na fagocitose e na diferenciação das células T.232 Quanto aos genes desativados, destacam-se os relacionados à matriz extracelular, silenciados no dia 7 (FBN2, ADAMTS5, COL4A5, COL14A1, PCOLCE, SPARCL1, FGFR1, GSN, MFAP2, OGN), bem como no dia 14 (COL4A5, COL16A1, FBLN1, FMOD, FLRT3). Como na AVBEH ocorre uma obliteração fibrosante progressiva das vias biliares, esses resultados não eram esperados. De modo diferente, Chen et al., em estudo com microarranjos que avaliou a expressão gênica no tecido hepático de pacientes portadores de atresia biliar no momento do transplante, tendo como grupo controle pacientes sadios e portadores de outras doenças colestáticas, observaram alta expressão dos genes classificados funcionalmente na classe da “morfogênese, fibrinogênese e remodelamento da matriz extracelular”, isto é, aqueles que codificam componentes estruturais ou modificadores da matriz extracelular.233 Outro estudo semelhante, realizado por Choe et al., demonstrou aumento da expressão de genes associados com a fibrose hepática. 234 Esses dois grupos de pesquisadores avaliaram pacientes em estágio avançado da doença, no momento do transplante, o que pode ter contribuído para os resultados. Entretanto, mesmo considerando que os animais da atual pesquisa foram sacrificados até 14 dias após a inoculação do RRV, quando ainda não havia cirrose hepática instalada, era esperado que o transcriptoma revelasse um aumento da expressão dos genes relacionados à deposição do colágeno e à matriz extracelular, o que não foi observado. O silenciamento dos genes que regulam a produção ou o remodelamento da matriz extracelular pode ter sido decorrente da pequena quantidade de células viáveis nas fases tardias da obstrução biliar. Além disso, pode ter ocorrido a exclusão de segmentos atrésicos durante a ressecção da árvore biliar extra-hepática. A microdissecção das vias biliares circundadas por tecido pancreático e mesentérico de camundongos no período neonatal, realizada neste estudo,150 constitui um desafio técnico, mesmo quando utilizado microscópio de dissecção. Para solucionar esse problema, em futuras análises deverá ser utilizado microscópio de captura a laser de alta resolução, instrumento capaz de possibilitar a seleção de segmentos atrésicos.235 Ainda nesse contexto, Lee et al., estudando pacientes portadores de atresia no momento da cirurgia de Kasai ou do transplante hepático, observaram que o aumento da expressão do TGF β2 (Transforming growth factor β 2) associa-se à progressão da doença e à fibrose.236 Os TGF β1 e β2 e seus receptores são potentes mediadores da fibrose,237 e os transcriptomas dos dias 7 e 14 demonstraram desativação do gene LTBP4 (Latent transforming growth factor beta binding protein 4). Os comentários citados anteriormente podem justificar a diferença entre esses resultados. Além disso, e de modo curioso, no dia 3 o gene VIL2 e no dia 14 o gene SVIL estavam desativados. Sabe-se que a secreção biliar requer o transporte de solutos orgânicos e inorgânicos do sangue e dos sinusóides para os canalículos biliares e que a villin é uma proteína do citoesqueleto, necessária para a manutenção e a integridade das microvilosidades do bordo estriado das células epiteliais canaliculares, nas quais os transportadores de membrana da secreção biliar estão localizados. Phillips et al. observaram que a expressão do gene VIL estava reduzida ou ausente nas crianças portadoras de doenças hepáticas colestáticas progressivas e sugeriram que esse gene pode desempenhar papel importante nesse tipo de doença.238 A contribuição de seu silenciamento na progressão da colestase no modelo animal utilizado nesta pesquisa ainda não foi estabelecida. Expressão diminuída ou ausente do gene VIL nas crianças portadoras de doenças hepáticas colestáticas progressivas. PHILLIPS, M. J. et al. Abnormalities in villin gene expression and canalicular microvillus structure in progressive cholestatic liver disease of childhood. Lancet 362, (2003).

Transdução de sinais Dia 14

Receptores do interferon I e ativação da via GAS
STAT5 Além disso, outro fator que se destaca é a desativação do sinal transdutor e ativador da transcrição 5 (STAT5). Esse é um importante elemento na via que sinaliza a produção do interferon I, via GAS,174 como demonstrado na Figura 58. Assim, no início do processo (dia 3), observamos o aumento da expressão do IRF7 e do IRF9, que estimulam a produção do interferon tipo I, No dia 7, detectamos evidências de aumento da sua produção, pela expressão de genes induzidos por ele e, finalmente, no dia 14, obtivemos evidências da desativação de genes que sinalizam a sua produção. Esses dados apontam mais uma rede seqüencial coordenada nesse transcriptoma.

Transdução de sinais Dia 7
A resposta da célula aos estímulos externos envolve os princípios de sinalização transmembrana, na qual sinais extracelulares são transmitidos, através da membrana plasmática, por proteínas receptoras, e convertidos em um evento bioquímico intracelular. A conversão do sinal de uma forma para outra é conhecida como transdução de sinal e desempenha papel fundamental em inúmeros processos biológicos.193 Dia 7

Vias moleculares relacionadas à imunidade
STAT1: sinalização do interferons ARHGDIB: sinalização mediada pela proteína Rho, crucial para a ativação da LFA1 CSF2Rβ1: estimula a produção de leucócitos CEBPβ: ativa a transcrição de genes da fase aguda e participa nos mecanismos que controlam a transcrição dos genes induzidos pelo interferon Vias moleculares relacionadas à imunidade

Controle da transcrição e da tradução
Dia 3

Ativados Replicação e no reparo do DNA: RBBP4, MCM3, RAD23B, TDG
Controle do ciclo celular: NDN Expressão gênica:  Controle transcricional: FUS, ATF4, ATF5, MEF2A, DHX9, TBX2, MTA2, NDN, TCERG1, PFTF1, SMARCE1.  Controle pós-transcricional - splicing do RNA: RNPC2; - tradução: PUM2, NOL5, EIF4EBP2, EIF4A1; - ubiquinização de proteínas: TRIM30, MKRN1. Processos imunes:  HRMT1L2: controla a transcrição do STAT1  IRF7e IRF-9: fator regulador de interferons  BACH2: controla a transcrição da AP-1 em células neurais e linfócitos Quanto aos genes relacionados ao controle da transcrição e da tradução, foram selecionados como ativados os que atuam no controle do ciclo celular, nas várias etapas da expressão gênica e nos processos imunes. Em relação à multiplicação celular, evidenciou-se a ativação de genes que atuam na replicação e no reparo do DNA (RBBP4, MCM3, RAD23B, TDG)249,255,256, bem como no controle do ciclo celular (NDN). Este último gene, em conjunto com a p53, inibe o ciclo celular.257 Quanto à expressão gênica, foram selecionados genes que influenciam tanto no controle transcricional como no pós-transcricional, como especificado a seguir:  Controle transcricional: FUS, ATF4, ATF5, MEF2A, DHX9, TBX2, MTA2, NDN, TCERG1, PFTF1, SMARCE1.  Controle pós-transcricional - splicing do RNA: RNPC2; - tradução: PUM2, NOL5, EIF4EBP2, EIF4A1; - ubiquinização de proteínas: TRIM30, MKRN1.227,249 Em relação aos processos imunes, o transcriptoma do dia 3 demonstrou ativação dos fatores de transcrição para importantes mediadores da resposta imune como:  HRMT1L2: controla a transcrição do STAT1;226  IRF7e IRF-9: fator regulador de interferons;175,176  BACH2: controla a transcrição da AP-1 em células neurais e linfócitos.258,259 Assim, no dia 3, foram ativados fatores de transcrição relacionados aos mediadores da resposta imune. Esses são aspectos interessantes, pois no dia 3 observa-se o aumento da expressão dos fatores de transcrição e no dia 7 constata-se um grande número de genes ativados relacionados à imunidade, inclusive do STAT1 e do interferon gama. Este último, quantificado por meio da RT PCR. Quanto aos desativados, observou-se intensa desativação das histonas (HIST1H1E, HIST2H2BE, HIST1H3A), que influenciam na formação dos nucleossomos, bem como dos que controlam a metilação do DNA (DNMT3A, CTCF). Sabemos que tanto a compactação do DNA em nucleossomos como a metilação do DNA induzem alterações da cromatina, as quais, por sua vez, diminuem a transcrição.260,261 Assim, a desativação desses genes também representa um estímulo para a expressão gênica. As alterações da acetilação da histona e da metilação do DNA são mecanismos de fenômenos epigenéticos, por meio dos quais a expressão gênica pode ser permanentemente alterada, mesmo sem haver alteração no genoma da célula. Um mecanismo epigenético importante consiste nas alterações da cromatina, que tem uma estrutura dinâmica e integra centenas de sinais da superfície da célula, por meio das alterações da histona, o que mantém o controle da resposta transcricional apropriada. Nesse caso, as mudanças da cromatina podem ocasionar alterações no comportamento da célula e as informações podem ser repassadas para gerações futuras, por meio da mitose, mantendo o comportamento da célula O papel dos fatores epigenéticos na patogênese da atresia foi avaliado por Zhang et al., em pesquisa que estudou o transcriptoma hepático de crianças portadoras de atresia das vias biliares extra-hepáticas, tanto da forma perinatal como da embrionária. Esses autores identificaram 230 genes com padrão de expressão distinto entre essas duas formas. O transcriptoma dos pacientes portadores da forma embrionária demonstrou a expressão de genes funcionalmente relacionados ao controle da estrutura da cromatina (SMARCA-1, HDAC3 e RYBP). De modo interessante, também houve aumento da expressão de dois genes (IGF2 e PEG10) regulados pelo HDAC3.57 A expressão dos genes que regulam a estrutura da cromatina constitui evidência de uma base transcricional na patogênese da forma embrionária da atresia, mas outros estudos são necessários para explorar o papel dos fenômenos epigenéticos na patogênese da atresia.

Desativados: fenômenos epigenéticos
Desativação das histonas (HIST1H1E, HIST2H2BE, HIST1H3A) Metilação do DNA (DNMT3A, CTCF). O papel dos fatores epigenéticos na patogênese da atresia: pacientes portadores da forma embrionária. Estrutura da cromatina: SMARCA-1, HDAC3 e RYBP ZHANG, D. Y. et al. Coordinate expression of regulatory genes differentiates embryonic and perinatal forms of biliary atresia. Hepatology 39, (2004). Quanto aos genes relacionados ao controle da transcrição e da tradução, foram selecionados como ativados os que atuam no controle do ciclo celular, nas várias etapas da expressão gênica e nos processos imunes. Em relação à multiplicação celular, evidenciou-se a ativação de genes que atuam na replicação e no reparo do DNA (RBBP4, MCM3, RAD23B, TDG)249,255,256, bem como no controle do ciclo celular (NDN). Este último gene, em conjunto com a p53, inibe o ciclo celular.257 Quanto à expressão gênica, foram selecionados genes que influenciam tanto no controle transcricional como no pós-transcricional, como especificado a seguir:  Controle transcricional: FUS, ATF4, ATF5, MEF2A, DHX9, TBX2, MTA2, NDN, TCERG1, PFTF1, SMARCE1.  Controle pós-transcricional - splicing do RNA: RNPC2; - tradução: PUM2, NOL5, EIF4EBP2, EIF4A1; - ubiquinização de proteínas: TRIM30, MKRN1.227,249 Em relação aos processos imunes, o transcriptoma do dia 3 demonstrou ativação dos fatores de transcrição para importantes mediadores da resposta imune como:  HRMT1L2: controla a transcrição do STAT1;226  IRF7e IRF-9: fator regulador de interferons;175,176  BACH2: controla a transcrição da AP-1 em células neurais e linfócitos.258,259 Assim, no dia 3, foram ativados fatores de transcrição relacionados aos mediadores da resposta imune. Esses são aspectos interessantes, pois no dia 3 observa-se o aumento da expressão dos fatores de transcrição e no dia 7 constata-se um grande número de genes ativados relacionados à imunidade, inclusive do STAT1 e do interferon gama. Este último, quantificado por meio da RT PCR. Quanto aos desativados, observou-se intensa desativação das histonas (HIST1H1E, HIST2H2BE, HIST1H3A), que influenciam na formação dos nucleossomos, bem como dos que controlam a metilação do DNA (DNMT3A, CTCF). Sabemos que tanto a compactação do DNA em nucleossomos como a metilação do DNA induzem alterações da cromatina, as quais, por sua vez, diminuem a transcrição.260,261 Assim, a desativação desses genes também representa um estímulo para a expressão gênica. As alterações da acetilação da histona e da metilação do DNA são mecanismos de fenômenos epigenéticos, por meio dos quais a expressão gênica pode ser permanentemente alterada, mesmo sem haver alteração no genoma da célula. Um mecanismo epigenético importante consiste nas alterações da cromatina, que tem uma estrutura dinâmica e integra centenas de sinais da superfície da célula, por meio das alterações da histona, o que mantém o controle da resposta transcricional apropriada. Nesse caso, as mudanças da cromatina podem ocasionar alterações no comportamento da célula e as informações podem ser repassadas para gerações futuras, por meio da mitose, mantendo o comportamento da célula O papel dos fatores epigenéticos na patogênese da atresia foi avaliado por Zhang et al., em pesquisa que estudou o transcriptoma hepático de crianças portadoras de atresia das vias biliares extra-hepáticas, tanto da forma perinatal como da embrionária. Esses autores identificaram 230 genes com padrão de expressão distinto entre essas duas formas. O transcriptoma dos pacientes portadores da forma embrionária demonstrou a expressão de genes funcionalmente relacionados ao controle da estrutura da cromatina (SMARCA-1, HDAC3 e RYBP). De modo interessante, também houve aumento da expressão de dois genes (IGF2 e PEG10) regulados pelo HDAC3.57 A expressão dos genes que regulam a estrutura da cromatina constitui evidência de uma base transcricional na patogênese da forma embrionária da atresia, mas outros estudos são necessários para explorar o papel dos fenômenos epigenéticos na patogênese da atresia.

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