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Princípios básicos: a) Amostras fecais múltiplas (ao menos 3) * devem ser testadas antes de ser considerada uma interpretação de diagnóstico negativa.

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1 Princípios básicos: a) Amostras fecais múltiplas (ao menos 3) * devem ser testadas antes de ser considerada uma interpretação de diagnóstico negativa. b) Para maximizar a recuperação de oocistos, amostras fecais devem ser concentradas antes do um exame microscópico (por exemplo, centrifugação a 500 X g, 10 min, por método da formalina-acetato de etila). c) A escolha das técnicas diagnósticas depende da disponibilidade de equipamentos e reagentes, experiência e considerações quanto a tempo e custo dos exames. Os métodos mais freqüentemente usados incluem: 1. Montagem a fresco: Sob microscopia de campo claro (contraste de fase ou DIC=differential interference contrast), oocistos se apresentam como esferas refringentes (8-10 µ m), com uma parede distinta. Entretanto, outros objetos podem apresentar características semelhantes. Sob microscopia de fluorescência-UV, a parede do oocisto adquire autofluorescência. Uma intensa fluorescência azul é observada utilizando-se conjunto de filtros de excitação UV na faixa de nm. Se este conjunto de filtros não for disponível, uma fluorescência verde de menor intensidade pode ser observada com filtro de excitação azul ( nm). Outros abjetos podem, entretanto, adquirir autofluorescência também. A utilização de microscópio com ambos os tipos de iluminação, campo claro e de fluorescência UV, constitui procedimento de diagnóstico eficiente e confiavel, quando presença de objetos autofluorescentes podem ser conferidos por observação em campo claro (e vice versa). Entretanto, isto requer um microscópio de fluorescência e não fornece um registro permanente como proporcionaria a lâmina corada que pode ser arquivada. 2. COLORAÇÃO DE KINYOUN (ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA): Um fundo azul-esverdeado da preparação fecal permite que os oocistos se sobressaiam. Estes se coram de forma variável: alguns se tingirão de rosa claro a púrpura intensa, enquanto outros podem não ficar corados.. Os oocistos (8-10 µ m) podem não ser perfeitamente redondos; alguns podem se apresentar em colapso ou distorcidos em um dos lados. * O conceito quanto ao uso de amostras fecais múltiplas está atualmente sobre revisão. Alguns estudos tem demonstrado que a primeira amostra é suficiente para proporcionar diagnóstico preciso em 90% dos casos. CYCLOSPORA PONTOS CHAVES PARA O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL I Esfregaço de fezes contendo oocistos de Cyclospora cayetanensis corados pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada (álcool-ácido-resistência modificada). Scale bar = 10 μm

2 COLORAÇÃO DE KINYOUN (CONTINUAÇÃO): Eles podem conter grânulos e/ou ter parede de oocisto com aparência enrugada (características que distinguem oocistos de artefatos de coloração). Este método de coloração é o mais fácil, e o mais prático, e permite um registro permanente. Além disso, as lâminas não precisam ser examinadas dentro de um período de tempo rígido e ficam disponíveis para arquivamento. Entretanto, erros de diagnóstico podem ocorrer em decorrência da variabilidade nas colorações e confusão com artefatos. 3. COLORAÇÃO PELA SAFRANINA: Oocistos se coram uniformemente em vermelho a vermelho-alaranjado. Esta coloração uniforme diminui o risco de erros de diagnóstico. Entretanto esta técnica requer aquecimento, e portanto equipamento adicional é necessário (ex: forno de microondas). 4. COLORAÇÃO PELO TRICRÔMIO (ou tricromo): (Oocistos podem ser detectados, mas não podem ser confirmados por este método) Oocistos aparecem como esferas (8-10 µ m) claras, arredondadas e ligeiramente enrugadas. A coloração pelo tricrômio é o método de coloração permanente na rotina da maioria dos laboratórios, e os técnicos devem estar familiarizados com a aparência da Cyclospora corada com tricromo para que os oocistos possam ser detectados nos exames de rotina. Este método de coloração é, entretanto, inadequado para diagnóstico definitivo, pois os oocistos aparecerão não corados, dificultando o estudo morfológico. Vale lembrar que os oocistos se coram de forma variável pela técnica de Kinyoun e mais uniformemente pelo método da safranina. As técnicas de diagnóstico acima referidas devem ser usadas para confirmação de Cyclospora quando este organismo é suspeito no corante tricromo. DIFERENCIAÇÃO ENTRE OOCISTOS DE CYCLOSPORA vs CRYPTOSPORIDIUM Tamanho: Cyclospora 8-10 µ m; Cryptosporidium 4-6 µ m. Esporozoítas: não visíveis no interior de oocistos de Cyclospora; podem ser discerníveis nos oocistos de Cryptosporidium Autofluorescência: presente na Cyclospora, ausente no Cryptosporidium. Teste de Anticorpo Fluorescente Direto: disponível para Cryptosporidium. Teste Imunoenzimático (ELISA): disponível para Cryptosporidium. CYCLOSPORA PONTOS CHAVES PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL II Esfregaço de fezes contendo oocistos de Cyclospora cayetanensis corados pela técnica da safranina.


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