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BOTULISMO - Diagnóstico Laboratorial. Procedimentos de Coleta e Técnicas para Detecção da Toxina em Pacientes e Alimentos - Miyoko Jakabi Instituto Adolfo.

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1 BOTULISMO - Diagnóstico Laboratorial. Procedimentos de Coleta e Técnicas para Detecção da Toxina em Pacientes e Alimentos - Miyoko Jakabi Instituto Adolfo Lutz - SES/SP

2 INTRODUÇÃO zBOTULISMO: doença que se manifesta pela ação de uma potente toxina produzida pelo Clostridium botulinum zDescrito pela primeira vez em 1879, por Ermengen, na Bélgica zBotulismo - botulus: salsicha

3 BOTULISMO zBotulismo alimentar: ingestão de alimentos contaminados com a toxina pré-formada zBotulismo Ferimento: causado pela multiplicação do microrganismo com produção de toxina em feridas contaminadas zBotulismo infantil:produção endógena de toxina pela germinação de esporos do C. botulinum no intestino (< 1 ano)

4 C. botulinum - características zBacilos retos ou ligeiramente curvos, Gram-positivos, imóveis, anaeróbios, 0,5-2,0 m de largura e 1,6-22,0 m de comprimento, esporos ovais e subterminais

5 C. botulinum z7 tipos de C. botulinum: A, B, C, D, E, F e G diferentes antigenicamente zA, B, E e raramente F: humanos zC e D: pássaros e bovinos zG (1970): não confirmado como causador de doença - (Argentina)

6 Esporos

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8 C. botulinum zToxina botulínica: proteína de 150 kda cadeia pesada de 100 kda e cadeia leve de 50 kda ligadas por pontes de sulfeto zToxina C 2 : 1 cadeia de 55 kda e 1 cadeia de 105 kda não são ligados covalentemente

9 Síntese da toxina zPresente em pequena quantidade na fase logarítmica zliberada durante a autólise zbacteriófagos: tipos C e D zplasmídeos

10 Ação da toxina botulínica zNeurotoxina zresistente ao ácido estomacal zabsorvida intacta pelo trato gastrointestinal e entra na corrente sangüínea zse liga as células nervosas via gangliosídeos

11 Cont. 1- ligação da cadeia leve aos receptores na membrana 2- Internalização da toxina ativa 3- translocação da toxina p/ o interior da célula (pinocitose) 4- fase lítica - bloqueio da liberação da acetilcolina

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13 Ação da toxina zO neurotransmissor envia impulsos elétricos p/contrair o músculo zterminações nervosas secretam a acetilcolina responsável pela contração muscular zpacientes com botulismo: neurotoxina liga-se aos terminais nervosos inibindo a liberação da acetilcolina, o músculo não contrai, ocorrendo a paralisia

14 C. botulinum no ambiente zLargamente distribuído no ambiente ztrato intestinal de animais, pássaros e peixes zcadáveres de animais silvestres e pássaros contém > quantidade ztipos A, B e F: terrestres ztipo E: ambientes aquáticos ztipo A: oeste dos EUA; ztipo B leste dos EUA e Europa; ztipo G: restrito a Argentina

15 Alimentos associados com botulismo zAlimentos enlatados ou envasados em vidros zindustrializados: subprocessamento ou contaminação pós-processo zconservas caseiras: subprocessamento e acidez

16 Alimento Infantil zMel: fonte significativa de C. botulinum zCereal de arroz e xarope de milho: números baixos de esporos

17 Botulismo

18 Diagnóstico laboratorial zPresença da toxina circulante, lavado gástrico ou conteúdo intestinal na fase inicial da doença zAnálise do alimento epidemiologicamente implicado

19 Método: Bioensaio zSoro zcentrifugação refrigerada zInoculação em 2 camundongos de 20-25g (0,5ml por animal) -IP

20 BIOENSAIO

21 Extração da toxina de alimentos, lavado gástrico e fezes zsolução de gel fosfato (1:1 p/v, homogeneização, manutenção por uma noite, geladeira) zCentrífuga refrigerada (4ºC/ a rpm/20 min.)

22 Tratamento do sobrenadante zSeparado em 2 porções: z tratada térmicamente: água ebulição/10 min. z tripsinizada: acertar o pH p/ 6,2; para cada 1,8 ml do sobrenadante, acrescente 0,2 ml de sol. Tripsina; incubar a 37ºC/1h OBS: toxina botulínica é termolábil se na amostra está presente só a pré toxina, é necessária a tripsinização para liberar a parte tóxica

23 Triagem da presença de toxina por bioensaio zSelecionar no mínimo 8 camundongos (20-25g) z2 animais: inoculados com porção fervida já resfriada z2 animais: inoculados com porção tripsinizada z2 animais: inoculados c/ a porção extraída, não tratada termicamente e não tripsinizada z2 animais são controle do ensaio

24 Sintomatologia - camundongos zOBS constantemente por 6 h zapós este período, os animais são observados a cada 6 h, até um período máximo de 72h zsintomas: respiração difícil, e elaborada, acinturamento tipo cintura de vespa, por paralisia do diafragma em contração zmorte

25 Confirmação da toxina botulínica zOs animais inoculados com a porção fervida não morrerem zos animais inoculados com a porção tripsinizada morrerem zanimais controle não morrerem OBS: Os animais inoculados com a porção não tratada podem ou não morrer. Caso morram, significa que a toxina ativa estava presente. Caso não morram, significa que a pré toxina estava presente.

26 Identificação da toxina zMisturar amostra positiva com anti-soros monovalentes (A,B,E e F) e polivalentes zInocular em camundongos zos animais inoculados, deverão apresentar os sintomas de botulismo, exceto aqueles que foram inoculados com a antitoxina que foi capaz de inativação

27 Interpretação zOs animais que não apresentarem sintomas permitem a identificação do tipo presente

28 Interpretação zSe os camundongos não forem protegidos por 1 dos monovalentes: 1- pode ter muita toxina no alimento 2- pode ter mais de 2 tipos de toxinas 3- mortes podem ser devidas a outras causas Se ambos os sobrenadantes, aquecido e não aquecido, forem letais, as mortes provavelmente não são devidas a toxina botulínica

29 Aplicação da toxina botulínica zTratamento de espasmos musculares de vários tipos: estrabismos, dores musculares de faces e pescoço zlimitação da terapia: injeção deve ser repetida

30 Botox

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