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Etiopatogenia das Doenças Priônicas e identificação genética do agente infeccioso Vilma Regina Martins, PhD Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer.

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1 Etiopatogenia das Doenças Priônicas e identificação genética do agente infeccioso Vilma Regina Martins, PhD Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer I SEMINÁRIO ESTADUAL DE VIGILÂNCIA DAS DOENÇAS PRIÔNICAS NO ESTADO DE SÃO PAULO 6 de novembro de 2006 Vila Mariana, São Paulo, SP.

2 Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis Animais Encefalolia Espongiforme Bovina (BSE) marta (MTE), cervo (CWD), felinos (FSE), antílopes (EUE) e primatas (ZPSE) Scrapie ovelhas e carneiros Humanos Kuru Doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) Insonia Familiar Fatal

3 Kuru BSE Scrapie CJD Encefalopatias Espongiformes transmissíveis (cérebros)

4 Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis Quem é o agente infeccioso? Quais são suas características físico-químicas? Como ocorre sua propagação?

5 Cérebro de animais infectados extrato Inoculação em um animal sadio Produção da mesma patologia vista no primeiro animal Purificação do agente infeccioso menor inóculo tem maior atividade infecciosa Caracterização do agente infeccioso

6 Susceptibilidade do agente infeccioso à UV scrapie (%) atividade Dose de UV gene bactéria bacteriófago

7 Características químicas do agente infeccioso Resistentes a agentes modificadores de ácidos nucléicos (nucleases e UV) Sensíveis a agentes modificadores de proteínas (proteases, SDS, fenol) Agente infeccioso sem material genético (DNA ou RNA) composto apenas de proteína (PrP sc ) Prions = proteinaceus infectious particle Stanley Prusiner, 1983

8 Identificação do agente infeccioso agente infeccioso purificado Imunização de coelhos Produção de anticorpos contra o agente infeccioso Reação positiva em cérebro infectado Reação positiva em cérebro NÃO infectado ??? Cérebro sadio tem uma proteína semelhante à infecciosa Prion celular

9 Como ocorre a geração de novo agente infeccioso na ausência de material genético? Proposta: A proteína infecciosa catalisa a formação de novas proteínas infeccionas a partir da homóloga normalmente produzida pela célula. Prova: Importância da proteína prion celular na doença.

10 Proteína prion celular Gene codificador PRNP Cromossomo 20 humano Cromossomo 2 camundongo Deleção de PRNP em camundongos Animais knockout para PrP c

11 Camundongo PRNP knockout Büller et al., Cell 73, , 1993 A presença da proteína celular é absolutamente necessária para o estabelecimento de infecção por prions! Incubation time (days) Animais sem doença (%) PrP +/+ CD-1 PrP 0/0 Tempo de incubação (dias)

12 Mecanismo de conversão PrP c - Prion PrP gene PrP mRNA PrP c Célula normal PrP gene PrP c PrP sc PrP mRNA Célula infectada Adaptado de Weissmann, 1994 Hipótese de protein only só proteína

13 PrP c Prion Normal Altamente insolúvel Deposição em placas Proteínas com diferenças conformacionais

14 Prions Proteinaceous infection particles Resistentes a agentes modificadores de ácidos nucléicos (nucleases e UV) Sensíveis a agentes modificadores de proteínas (proteases, SDS, fenol) Contém uma forma anormal de uma proteína celular, PrP c Diferem de PrP c apenas estruturalmente Presença de PrP c é absolutamente necessária para a infecção

15 Doenças humanas por prions Infecciosas/Iatrogenicas Transplante de córnea (CJD) Inoculação acidental de tecido cerebral(CJD) Hormônio de Crescimento (cadáver) canibalismo (Kuru) vCJD injestão de carne contaminada com BSE Genéticas Mutações no gene de Prion celular GSS, FFI, CJD Esporádicas caso completamente desconhecido 1:2,000,000

16 BSE X vCJD 2000 – 79 cases of vCJD (Hilton DA, J. Neuroph. Appl. Neurobiol 26 (5), )

17 Evidências da transmissão do BSE para humanos Transmissão de BSE para macacos induziu a formação de placas floridas similares às presentes na nvCJD. Prion Biology and Diseases, Stanley Prusiner, 2ª edição, 2003

18 Do intestino ao cérebro Translocação através do epitélio intestinal Mabbott & MacPherson, Nat. Ver. Microb. 4: , 2006

19 Neuroinvasão a partir do intestino Splanchnic nerve Vagus nerve Mabbott & MacPherson, Nat. Ver. Microb. 4: , 2006

20 Gado bovino EEB - BSE Humanos nvCJD Scrapie ovelha Humanos Cervos Chronic Wasting Disease CWD Barreira entre espécies Transplantes Transfusão sangüínea ? Barreira entre espécies Barreira entre espécies

21 Possible transmission of variant Creutzfeldt-Jakob disease by blood transfusion C A Llewelyn, P E Hewitt, R S G Knight, K Amar, S Cousens, J Mackenzie, R G Will Findings 48 individuals were identified as having received a labile blood component from a total of 15 donors who later became vCJD cases and appeared on the surveillance units register. One of these recipients was identified as developing symptoms of vCJD 6·5 years after receiving a transfusion of red cells donated by an individual 3·5 years before the donor developed symptoms of vCJD. Interpretation Our findings raise the possibility that this infection was transfusion transmitted. Infection in the recipient could have been due to past dietary exposure to the BSE agent. However, the age of the patient was well beyond that of most vCJD cases, and the chance of observing a case of vCJD in a recipient in the absence of transfusion transmitted infection is about 1 in to 1 in THE LANCET Vol 363 February 7, 2004

22 FormaFenótipo AdquiridaKuru Doença de Creutzfeldt-Jakob iatrogênica (iDCJ ou iCJD) Doença de Creutzfeldt-Jakob nova variante(vdcj ou vCJD) Familial (hereditária)fDCJ ou fCJD) Insônia Familiar Fatal (IFF ou FFI) Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) Mista ou indeterminada EsporádicasDCJ ou sCJD Típica (MM1 MV1) Aparecimento precoce(VV1) Longa duração (MM2) Placas de Kuru (MV2) Atáxica (VV2) Insônia Fatal (sIF) Doenças humanas por prions

23 ORF EXON IINTRONEXON II ORF mRNA 5 AnAn Prnp O gene PRNP e a proteína prion celular

24 NH 2 COOH octa P L A V y STOP N S D N V I F S E K V I Q R M R 4 ou 5 8 P L CJD GSS Doença Psiquiátrica CJD ou FFI Mutações na proteína PrP c associadas a doenças herdadas de padrão autossômico dominante Martins e cols, in Neuropsiquiatria Geriátrica, T A

25 Sporadic CJ FFI GSS New variant CJD Curvas de mortalidade distribuídas por sexo e idade FFI

26 nvCJD X CJD esporádico idade (anos) 2960 Duratção (meses)145 Sintomas iniciais Anormalidades Psiquiátricas Demência Sintomas sensitivos Sintomas cerebelares (% dos pacientes) nvCJDesporádico

27 Codon 129 polimorfismo M129M 37% M129V 52% V129V 11% Presença de polimorfismos no gene PRNP

28 Polimorfismo no codon 129 e susceptibilidade às doenças por prions Doença # indivíduos MET/ MET % MET/ VAL % VAL/ VAL % sadios CJD esporádico CJD Iatrogênico vCJD24982-

29 Procedimentos de diagnóstico para doenças por prions Cérebro, orgãos linfóides e músculo esquelético Dosagem da proteína Em LCR Avaliação de polimorfismos/mutações no gene PRNP

30 Identificação de polimorfismos e/ou mutações no gene de prion celular (PRNP ) Sangue periférico Separação dos leucócitos Purificação do DNA Seqüênciamento direto DHPLC Cromatografia líquida de alta resolução

31 Identificação de polimorfismos e/ou mutações no gene de prion celular (PRNP ) Coleta de 5 ml de sangue periférico com anti coagulante (K 3 EDTA) Envio ao Centro de Referência 4ºC – máximo 12 h -20ºC – maior tempo de armazenamento Gelo seco Gelo reciclável


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