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Prof. Odir A. Dellagostin Biblioteca Genômica e de cDNA.

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1 Prof. Odir A. Dellagostin Biblioteca Genômica e de cDNA

2 Biblioteca Genômica É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um determinado organismo

3 Características das Bibliotecas de DNA São usadas para principalmente para procariotos Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para estudo de regiões reguladoras Independe do típo de célula utilizada para a obtenção do DNA

4 Biblioteca de cDNA É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mRNA. É usada principalmente para células eucarióticas. Varia de acordo com o tecido utilizado.

5 Etapas na construção de uma Biblioteca

6 Bacteriófagos Bacteriófagos

7 Cosmídios

8 É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens diferentesÉ a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens diferentes Hibridização Renaturação HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

9 Triagem de Bibliotecas Genômicas Diagnóstico molecular Tipagem molecular Teste de paternidade Medicina forense Aplicações

10 Triagem de uma biblioteca Conhecer parte da seqüência do gene Seqüência completa do gene Sonda de DNA Utilizar sonda de oligonucleotídeos derivado de uma proteína Codon degenerado Conhecer cerca de 6 aa contíguos Anticorpos

11 1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos

12 Marcação da Sonda de DNA Radioativa: 32 PRadioativa: 32 P Não radioativa: peroxidase, fosfatase alcalinaNão radioativa: peroxidase, fosfatase alcalina SONDA de DNA - Seqüência de DNA Marcada

13 Marcação da Sonda de DNA Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalinaEnzimática: peroxidase, fosfatase alcalina Desnaturação DNA DNA fita simples Ligação Fraca (DNA+ Peroxidase) Sondas Covalentemente marcada com a enzima + peroxidase complexada com polimero positivo + glutaraldeído

14 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização Placas com Colônias contendo os plasmídeos Lise das Bactérias – Desnaturação do DNA Sonda Filme de Raio - X

15 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização

16 Caracterização da seqüência encontrada Seqüenciamento de DNA Seqüenciamento de DNA PCR PCR Expressão da seqüência codificadora Expressão da seqüência codificadora

17 Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western Blot - Proteína

18 Sonda: seqüência de DNA marcada Transferência de DNA do gel para a membrana Southern Blot

19 NORTHERN BLOT 4. Geração de uma sonda marcada pGEM-T dATP dGTP dTTP dCTP 1. Extração do DNA 2. Eletroforese do RNA 3. Transferência para a menbrana 5. Hibridização 6. Visualização


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