Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

Apresentação em tema: "Profa. Dra. Ana Elizabete Silva"— Transcrição da apresentação:

1 Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
AVANÇOS DA CITOGENÉTICA MOLECULAR NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP

2 Décadas 70-80: estudo citogenético  identificação de cromossomos e regiões cromossômicas  diferentes alterações Perda: deleção monossomia Ganho: duplicação, amplificação trissomia, poliploidia Relocação: translocação inversão inserção

3 CULTURA CELULAR E BANDA G
500 bandas Resolução: ~6milhões pb ~50genes/banda >4 Mb

4 CITOGENÉTICA MOLECULAR
Pinkel et al. (1986): Aplicações de técnicas de biologia molecular em preparações citogenéticas: sondas marcadas com fluorocromos Identificação de rearranjos cromossômicos de novo e cromossomos marcadores Detecção de alterações cromossômicas em núcleos interfásicos Estudo da estrutura e função de regiões cromossômicas específicas

5 TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR
FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação) SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações) M-BAND: Bandamento colorido (inversão, deleção/duplicação) CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos) Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)

6 HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE FISH

7 HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)

8 DNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica
Sonda: segmento de DNA específico

9 http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm - ANIMAÇÃO

10 ETAPAS Pré-tratamento: Ácido acético RNase e pepsina Desidratação Etanol Preparação da lâmina (DNA alvo) Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa temperatura de ~80oC Fluorocromos: Sondas FITC-fluoresceína (verde) Espectrum green ( verde) Rodamina (vermelho) Texas red (vermelho) Hibridização sonda/DNA (estufa a 37oC – câmara úmida - overnight) Lavagem pós-hibridização: tampão 2xSSC (citrato de sódio) Detecção da sonda e contracoloração: iodeto de propídeo (PI) ou DAPI

11 ETAPAS Material: -núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços -cromossomos metafásicos: cultura celular

12 ETAPAS (Ácido acético, RNase, pepsina)

13 ETAPAS Hibridização (câmera úmida à 37oc)
Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência

14 TIPOS DE SONDAS Sondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas: -sonda alfa-satélite (centromérica) -sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G) -sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y) -sonda telomérica (telômeros) Sondas de cópia única ou locus específica Sondas de cromossomo inteiro – Whole-chromosome painting

15 TIPOS DE SONDAS

16 TIPOS DE SONDAS

17 SONDAS CENTROMÉRICAS Enumeração dos cromossomos e aneuploidias

18 aneuploidias em núcleos interfásicos
SONDAS CENTROMÉRICAS gastrite: -7 gastrite:+7 APLICAÇÃO: aneuploidias em núcleos interfásicos úlcera: +8 Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)

19 SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
del (21q11.2) Diagnóstico de doenças com microdeleção

20 SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
Deficiência da esterase sulfatase (Xp22.3)

21 SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
Adenocarcinoma gástrico: Deleção TP53 1 sinal vermelho Mucosa normal: TP53 (vermelho) 17 (verde) Deleção do gene TP53 em câncer gástrico

22 SONDAS WCP – Cromossomo Total

23 SONDAS WCP – Cromossomo Total
Detecção de Translocação recíproca balanceada

24 SONDAS WCP – Cromossomo Total
A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4 (material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), B-  Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta).

25 SONDAS TELOMÉRICAS

26 SONDAS TELOMÉRICAS Aplicação: -Deleções terminais -perdas teloméricas

27 SONDAS TELOMÉRICAS (cromossomo 5)

28 APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH
Mapeamento de genes e sequências gênicas Estrutura e organização dos cromossomos Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções Identificação de alterações cromossômicas em esperma Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto) Diagnóstico de neoplasias

29

30

31

32 DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO
APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO

33 DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X: aneuploidias mais comuns relacionadas com idade materna avançada e malformações fetais Citogenética convencional: diagnóstico em 8-15 dias FISH: resultado rápido (2-3 dias) em células do líquido amniótico não cultivadas

34 DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH

35 DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Normal Trissomia do 21 Triplo X

36 DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO
3 sinais vermelho: blastômero com trissomia do 21

37 DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
AMPLIFICAÇÃO GÊNICA CCND1, c-MYC, HER2/Neu TRANSLOCAÇÕES t(9,22); t(8;14) DELEÇÕES TP53 (17p13), RB (13q13)

38 DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
Amplificação Gênica

39 DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
Amplificação Gênica (C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)

40 DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

41 DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

42 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY

43 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Schrock et al., Science 273: , 1996 Identificação precisa e simultânea de todos os cromossomos humanos: diferentes cores Princípio: medição simultânea de todos os pontos do espectro emitidos pela amostra na faixa espectral visível e próxima a infra-vermelha: uso de múltiplas sondas sobrepondo-se espectralmente Sondas: com 5 diferentes fluorocromos : Cy2, Spectrum green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas combinações

44 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Sondas dos 24 cromossomos humanos marcadas com 5 fluorocromos em combinação resultando em uma cor diferente para cada cromossomo.

45 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Classificação das cores pseudo-coloridas Cor capturada

46 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Cromossomos marcadores Cariótipo normal

47 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Inverted-DAPI (A) and SKY classified (B) karyotypes of the previous lung SCC cell. -6 -8 A B t(1;16) t(5;9;13) t(6;8;15) t(6;7) t(6;15) t(11;19) Limitação: -Cultivo celular – metáfases -Não detecta deleções/duplicações e inversão

48 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Evolução cariotípica: células de gibão hibridizadas com sondas humanas  várias homologias cromossômicas

49 BANDAMENTO COLORIDO CROSS-SPECIES COLOR BANDING

50 BANDAMENTO COLORIDO Permite a coloração sub-regional dos cromossomos para análise do cariótipo humano Sondas: derivadas de primatas (gibões) do genêro Hylobates concolor e Hylobates syndactilus: cariótipos com extensa reorganização cromossômica quando comparado ao homem Identificação de rearranjos cromossômicos: inversões, deleções, duplicações, inserções, translocações

51 BANDAMENTO COLORIDO mBAND do cromossomo 5:
25 bandas coloridas: corresponde a uma resolução de 550 bandas (complemento haplóide)

52 BANDAMENTO COLORIDO Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem re-processada (b), ambas esteroscópicas. Qualquer alteração pode ser detectada por este sistema. 

53

54 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

55 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
Método para detectar simultaneamente ganhos e perdas de regiões genômicas sem precisar de células em divisão Extração do DNA: células teste (tumor) e referência (normal) DNA digerido com enzimas de restrição e marcados com fluorocromos diferentes (vermelho e verde) Hibridação simultânea com ambos DNA (teste e referência) sobre lâmina com cromossomos metafásicos normais Comparação intensidade relativa dos dois fluorocromos ao longo do comprimento de cada cromossomo

56 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

57 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
Amplificação/ganho: excesso do DNA teste (verde) Deleção/perda: excesso do DNA normal (vermelho)

58 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

59 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

60 Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em câncer gástrico (Guan et al

61 array - CGH -cromossomos metafásicos substituídos por sondas de DNA ou oligonucleotídeos  chips DNA Resolução: 0,5 Mb

62 array - CGH Análise dos sinais fluorescentes: analisador de imagem, scanner confocal ou câmera CCD

63 array - CGH

64

65 AVANÇOS TECNOLÓGICOS 1o. Microscópio -Leeuwenhoek

66 AVANÇOS TECNOLÓGICOS

67 Array-CGH continua transformando a Citogenética:
-fornecendo alta-resolução -tecnologia avançada para mapeamento preciso e detecção de aberrações cromossômicas.