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TESTES USADOS EM DIAGNÓSTICO E TITULAÇÃO VIRAL. Métodos de Detecção Viral 1) Buscar o Vírus O vírus propriamente Proteínas Virais Efeitos virais in vitro.

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1 TESTES USADOS EM DIAGNÓSTICO E TITULAÇÃO VIRAL

2 Métodos de Detecção Viral 1) Buscar o Vírus O vírus propriamente Proteínas Virais Efeitos virais in vitro Genoma Viral

3 1 – Investigação Direta (buscar o vírus) Microscopia Eletrônica morfologia viral Detecção do vírus (antígeno) IFA, ELISA, AGLUTINAÇÃO, etc Detecção do Genoma Viral Hibridização molecular Amplificação gênica (PCR ou derivados)

4 Tecidos e/ou matrizes onde se pode buscar o vírus Aspirato NasofaringealVírus Respiratório sincicial Influenza A and B Parainfluenza Adenovirus FezesRotavirus Adenovirus Astrovirus Norovirus, etc Fluidos Herpes Simples HIV Esfregaços HPV, HIV Biópsias HIV, EBV, et

5 Microscopia Electrônica 10 6 partículas virais/mL são necessárias para visualização. Exemplos: Fezes ……………………Rotavirus, Adenovirus, Norovírus Astrovirus, Calicivirus Mucosas ………………….Papilomavirus (HPV)

6 Eletromicrografias Adenovirus RotavirusHerpes Simples Raiva Astrovírus HIV

7 Imuno Microscopia Eletrônica (IME) A sensibilidade e a especificidade da ME pode ser aumentada por associação a técnicas imunológicas. Existem duas variantes: Microscopia Eletrônica Imune Clássica (MEI) - A amostra é tratada com anti-soros específicos antes de ser analisadas no ME. Partículas virais aglutinadas Microscopia Eletrônica de Fase Sólida (MEIFS) - uma grade revestida com anticorpos específicos anti-soros é colocada em contato com a amostra. Partículas virais serão absorvidas na grade - pelo anticorpo.

8 Problemas com a Microscopia Eletrônica Equipamentos e manutenção – custos elevados Requer bastante experiência do observador Passiva de falsos negativos/baixa sensibilidade (depende da origem amostral)

9 BUSCAR AS PROTEÍNAS VIRAIS Testes Imunológicos: ELISA, IMUNOHISTOQUÍMICA, IMUNOFLUORESCÊNCIA CITOMETRIA DE FLUXO RADIOIMUNOENSAIO

10 ELISA - Ensaio Imunoenzimático O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, é feito através de leitura em fotocolorímetro.

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12 IMUNOHISTOQUÍMICA: detecção de células infectadas em cortes histológicos (EBV, HPV)

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14 Célula infectada por Rotavírus Símio

15 Citometria de Fluxo (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

16 RADIOIMUNOENSAIO (RIA): triagem do vírus da hepatite B em doadores de sangue

17 Investigação Indireta (buscar o efeito do vírus; isolar o vírus; atenuar o vírus) Cultura celular ou ovos embrionados: Efeito citopático (CPE) ou infecção do embrião Uso de Animais: Estudo da doença e/ou morte

18 Como isolar vírus? - a partir dos tecidos infectados (limitado) - células em cultura - ovos embrionados CULTURA CELULAR 1. Cultivo celular primário (derivado do tecido) 2. Cultivo em linhagens celulares semi-contínuas (Ex: fibroblastos de rins de macaco) 3. Cultivo em linhagens celulares contínuas (tumorais) - HeLa, Vero, Hep2, A549…

19 Todos os vírus podem ser cultivados in vitro?

20 Linhagens Celulares – Visualização de Efeito Citopático Controle Celular Controle Viral (PV) Amostra ambiental Positiva para Enterovírus (7 dias) Amostra ambiental Positiva para Enterovírus (4 dias) Efeitos citopáticos clássicos

21 ATENUAÇÃO DE VÍRUS PARA PRODUÇÃO DE VACINAS

22 Ensaio de Formação de Placa de Lise (Contagem em PFU) 1- Diluições Seriadas 2- Infecção Celular Quantificação Viral em cultura celular

23 Ensaio de Formação de Placa de Lise (Contagem em PFU) 1- Diluições Seriadas 2- Infecção Celular Quantificação Viral em cultura celular

24 Desafios em Cultivos Celulares Às vezes requerem longos períodos e mais de uma passagem para obter resultados A matriz de onde provém a fonte viral pode ser um obstáculo (sangue, amostras ambientais, mucosas, fezes…) Suceptível a contaminações bacterianas e fúngicas Suceptível a substâncias tóxicas presentes na amostra Muitos vírus não são adaptados ao cutivo celular in vitro (hepatites, diarréias, papilomavírus…)

25 Cultivo de Vírus em Ovos Embrionados Isolamento Viral – Inoculações em Ovos Embrionados

26 Cultivo Celular para Isolamento e Viabilidade Viral - Vírus da Bronquite Aviária Passagem 1 Passagem 2 Passagem 3 Passagem 4

27 27 Teste rápido, fácil e barato Pode ser utilizado para detectar anticorpos para o vírus ou inibição da hemaglutinação Mede quantidade total de vírus (não somente vírus infecciosos) Testes de Hemaglutinação

28 28 Testes de Hemaglutinação Alguns vírus, ou antígenos derivados de vírus, se adsorvem às hemácias através de receptores existentes na membrana destas. Como resultado, as hemácias aglutinam, sendo este fenômeno denominado de hemaglutinação. Vírus de influenza: aglutina hemácias de galinha, cobaia, carneiro e humanas do grupo O. Vírus do Sarampo: Aglutinam hemácias de macaco. Vírus do Dengue: Aglutinam hemácias de ganso

29 As hemaglutininas de vírus respiratórios são antigênicas e, quando um vírus infecta o organismo humano ou animal, além de anticorpos neutralizantes, há a produção de anticorpos específicos contra as hemaglutininas virais. Esses anticorpos presentes no soro são capazes de se combinar com o vírus in vitro, inibindo assim a hemaglutinação. Este é o princípio da reação de inibição da hemaglutinação, que tem grande utilidade no diagnóstico dessas infecções virais. TESTES DE INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO

30 Buscar o genoma viral Utiliza técnicas que identificam e/ou quantificam o genoma viral AMPLIFICAÇÃO GÊNICA HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES

31 Métodos Moleculares Métodos baseados na detecção de genoma viral, conhecido como moleculares, são muito utilizados. PCR Dot-blot Southern blot A especificidade depende das condições da reação (otimização) Mais utilizada! Busca PubMed: publicados (últimos 8 nos) (Acesso em )

32 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Amplifica a sequência alvo de DNA/cDNA, permitindo detectar o genoma viral buscado. É baseada em uma reação enzimática com uso de oligonucleotídeos que flanqueiam a sequência alvo que será aplificada pela ação da enzima DNA Polimerase. Graças a Taq Polimerase, enzima termoestável, a reação é possivel em um único MIX de reagentes; Ciclos repetidos (usualmente 25 – 40 ciclos) de desnaturação do DNA (94 o C), anelamento dos oligos / primers (50 o C – 65°C) e extensão dos primers (72 o C) resultam em uma produção exponencial do fragmento expecífico; Atualmente a qPCR está sendo amplamente utilizada – Permite quantificar em cópias genômicas o fragmento detectável.

33 Esquema de PCR

34 VÍDEO PCR

35 Os iniciadores procuram o molde na molécula de DNA, sequências que lhes são complementares O pareamento dos iniciadores com a sequência que lhe é complementar já está bem facilitada, pois já existem várias cópias das sequências alvos. A amplificação já é sub- ótima devido à limitação dos reagentes - competição dos produtos gerados com os iniciadores Cinética da PCR

36 Reação em Cadeia da Polimerase Vantagens da PCR - Altamente sensível (pequena quantidade de material genético é requerido) - Rápida Desvantagens of PCR – Passiva de contaminações – Alto treinamento do manipulador – Se PCR qualitativa (Resultado não quantifica) – Não acessa a infecciosidade viral – Relativamente custosa (25 Reais/reação) qPCR

37 HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES

38 Detecção de EBV em corte histológico de linfonodo com doença linfoproliferativa pós-transplante. Detecção de EBV em corte histológico de linfonodo com linfoma de Hodgkin.

39 Detecção de HPV por FISH (HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTE)

40 Métodos de Detecção Viral 2) Buscar a resposta ao vírus

41 Investigação sorológica (buscar a resposta imune ao vírus) Detecção de de anticorpos presentes no soro nas fases aguda (IgM) e/ou convalescente da infecção (IgG ou IgA). ELISA WESTERN BLOT CITOMETRIA DE FLUXO IMUNOFLUORESCÊNCIA

42 Sorologia Diagnosticando Infecções Primárias: - Pelo aumento de IgG e/ou IgA (dependendo do alvo do vírus) - Presença de IgM no soro indicando infecção primária - Soroconversão Diagnosticando Reinfecções ou Infecções secundárias - IgG ou IgA (dependendo do alvo do vírus) no soro e/ou fluidos corpóreos

43 Perfil Sorológico das Infecções Virais

44 ELISA – Ex: Teste para HIV

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46 Western Blot Eletroforese de proteínas. Identifica antígenos ou anticorpos.

47 Western Blot HIV-1 Western Blot Linha 1: Controle Positivo Linha 2: Controle Negativo A: Negativo B: Indeterminado C: Positivo

48 Utilidade dos Resultados por Sorologia Resposta específica ao vírus. Em caso de doenças assintomáticas a detecção sorológica (IgM e IgG) indica doença. Existem vírus que produzem efeitos clínicos após soroconversão (HIV, RAIVA).

49 Problemas com Sorologia Requer longos períodos para diagnosticar a infecção. Possibilidades de resultados falsos positivos (imunocomprometidos).

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