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Caracterização de genes de resistência a insetos Marcelo Menossi Laboratório de Genoma Funcional Centro de Biologia Mol. Engenharia Genética

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Apresentação em tema: "Caracterização de genes de resistência a insetos Marcelo Menossi Laboratório de Genoma Funcional Centro de Biologia Mol. Engenharia Genética"— Transcrição da apresentação:

1 Caracterização de genes de resistência a insetos Marcelo Menossi Laboratório de Genoma Funcional Centro de Biologia Mol. Engenharia Genética

2 Coffea arabica (75%) e Coffea canephora (25%) 13 estados produtores 9 milhões de empregos diretos e indiretos 2 bilhões de dólares em receita 2 milhões de hectares 150 cooperativas e empresas exportadoras registradas indústrias de torrefação e moagem Segundo país maior consumidor do produto Café no Brasil

3 Nematódeos Meloidogyne sp. Fungos Ferrugem do café (Hemileia vastatrix) Insetos Broca do Café (Hypothenemus hampei) Bicho mineiro (Leucoptera coffeella) Estresse Biótico e o Café

4 Ciclo de vida do bicho mineiro Incubação dos ovos à eclosão Das lagartas - 4 a 6 dias Desenvolvimento da lagarta - 7 a 11 dias (dano) Mariposa Oviposição Formação da crisálida Eclosão da lagarta Duração da fase pupal – 5 a 8 dias Duração da fase adulta - 5 a 20 dias (fêmeas)

5 Instituto Agronômico de Campinas - Hibridações entre C. arabica e C. racemosa (resistente) - Avaliação da quinta geração de retrocruzamentos Indivíduos resistentes e suscetíveis Cultivares resistentes

6 Defesa Constitutiva- Barreiras Físico-químicas Defesa Induzida - Expressão gênica Transdução de sinal Reparação do tecido Ajuste metabólico Inibição do crescimento do predador Defesas contra herbivoria

7 Identificar e caracterizar a expressão de genes que possam estar relacionados com a expressão da resistência do cafeeiro ao bicho-mineiro Avaliar esses genes como possíveis marcadores moleculares de resistência ao bicho-mineiro Objetivos

8 Arranjos de DNA Arranjos em lâmina - Microarrays Arranjos em membrana - Macroarrays

9 Arranjos de DNA * * * * * * * * * * * * * * * * * ** * * * * * * * * * * ** * * * * * Sonda células controle Sonda células tratadas * * * * * * * * * * Hibridação Macroarray A1Macroarray A2 Detecção do sinal e análises * *

10 Bibliotecas de subtração Enriquecidas em cDNAs diferencialmente expressos DriverTester Sem amplificação Amplificação Exponencial Amplificação Linear Eliminado Driver Driver e Tester Tester Tester Enriquecido genes sem interesse genes de interesse

11 Resultados Avaliação do nível de resistências das plantas Resistentes Suscetíveis

12 Experimento de infestação RS Resistentes e Suscetíveis 3 dias pós infestação (oviposição) 7 dias pós infestação (eclosão) Ro e So Re e Se Rc e Sc Controle (sem infestação) C O E

13 Estratégia - Biblioteca de Subtração Tester (genes de interesse) Driver (genes descartáveis) Genes induzidos preferencialmente nas resistentes pós infestação Resistente após oviposição + Resistente após eclosão Resistente controle Suscetível controle Suscetível após oviposição Suscetível após eclosão

14 Resultados subtração DP1DP2DP3 Vários ciclos de subtração Não normalizada Único ciclo de subtração Efeito de normalização Representational Diference Analysis (RDA) Supressive Subtraction Hybridization (SSH)

15 Hibridação com sondas de cDNA Membranas de náilon contendo 768 clones da biblioteca de subtração, hibridadas com sondas de cDNA Resistente - controleResistente - pós eclosão

16 Normalização - Fator normalizador: intensidade do background das membranas em regiões que não continham spots Seleção - spots réplica apresentaram intensidade maior que 10% do background e com variação de sinal menor que duas vezes entre spots réplicas Cálculo da média entre spots réplicas ESTs cujo valor máximo das médias dos spots de um dos tratamentos com cDNA de plantas resistentes infestadas (Ro ou Re) for maior que duas vezes o mínimo de um dos outros tratamentos (Rc, Sc, So ou Se) Análise dos dados

17 SOM- Self Organizing Maps 260 ESTs selecionados. C O E ResSus

18 Genes Induzidos (exemplos) 16,5% de clones de RDA (143) – alta redundância 17 % dos clones do SSH (117) – baixa redundância

19 Confirmação por northern blot RcRoReScSeSo SSH 101B04 SSH 201D09 SSH 104G04 SSH 202H06 SSH 202C10 DP3 102B11

20 RDA- Ideal para amostras com diferença de indução de 10x SSH- Ideal para amostras contendo muitos transcritos diferencialmente expressos Análise da estratégia Subtração + Macroarray ?Tente conhecer seu modelo experimental Falso positivos 260 genes diferencialmente expressos

21 EpidermeMesofilo TRÁFICO INTRACELULAR Peptidase sinal SECY METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS, AÇÚCARES E VITAMINAS METABOLISMO SECUNDÁRIO ESTRESSE OXIDATIVO PROTEÓLISE PROTEÍNAS EFETORAS Glutamato decarboxilase Tiamina sintase Acetil COA sintase GST Catalase psaH Fosfocitidil sintase Flavonol transferase Quitinases Inibidor de protease Metaloprotease FUNÇÃO DESCONHECIDA No hits Unknown protein TRANSDUÇÃO DE SINAL GTPase, Quinases, Trocador Na/Ca FATORES DE TRANSCRIÇÃO MYB, Homeoproteína BELL Proteína associada à senescência RD22 – Proteína anti-seca ESTRESSE ABIÓTICO Oviposição Eclosão ? Modelo inicial das defesas da planta

22 Próximas etapas Análise da expressão dos genes diferencialmente expressos Análise de segregação em Southern blot de plantas resistentes e suscetíveis

23 Equipe CBMEG - Unicamp Jorge Mondego (Dr.) Juliana de Maria Felix (Dr.) Rodrigo Drummond (Dr.) Renato Vicentini (IC) Cristiane Rocha (IC) Melina P. Duarte (IC) Dr. Marcelo Menossi IAC Dr. Oliveiro Guerreiro Filho Dra. Míriam Maluf Daniel Ramiro (MSc.) Silvia Chebabi (M.Sc.) IMECC – Unicamp Dr. Aluisio S. Pinheiro IQ-USP Prof. Dra. Mari Cleide Sogayar Dr. Mario Henrique Bengtson Christian Colin (Dr.) União Européia CNC PNP&D


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