1975 - Stanley Cohen Plasmídeo.

Apresentação em tema: "1975 - Stanley Cohen Plasmídeo."— Transcrição da apresentação:

1 Stanley Cohen Plasmídeo

2 Conferencia de Asilomar - 1975 Pacific Grove - California USA
- 139 cientistas de 17 nações - Recombinant DNA Advisory Commitee - RAC Normas para contenção biológica - P1  P4

3 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO W. Alber H. Smith D. Nathans

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5 Ferramentas de trabalho
Enzimas de restrição Sistema restrição/modificação Tipo II - utilizadas na TDR: reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA - palíndromos, atuam como verdadeiras tesouras moleculares Tipos de cortes: Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) Produção de terminais abruptos (ou cegos)

6 b) Clivagem simétricamente situada ao redor do eixo de simetria
a) Clivagem no eixo de simetria ...TC GA... ...GAA TTC... ...AG CT... ...CTT AAG... 3 ’ 5 ’ + 5 ’ 3 ’ 3 ’ + 5 ’ 5 ’ 3 ’ Moléculas com extremidades abruptas Moléculas com extremidades coesivas

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10 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

11 Enzima de restrição EcoRI

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15 A tecnologia do DNA recombinante

16 Ligação DNA plasmidial - vetor Fragmento de DNA - inserto LIGASE
Extremidades coesivas Fragmento de DNA - inserto LIGASE

17 Construção do DNA Recombinante
Molécula de DNA de um plasmídeo circular Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas anelamento Clivagem com enzima de restrição Ligação covalente pela DNA ligase Inserção em uma célula hospedeira Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

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19 Vetores Hospedeiros Utilização
clonagem Plasmídeos Bactérias / leveduras Cosmídeos Bacteriófagos Células eucarióticas Terapia gênica Virus

20 Tipos de Vetores Plasmídeos: são usados para clonar fragmentos de DNA de vários pares de bases a centenas de pares de bases. Bacteriófagos: são usados para clonar fragmentos de DNA de pares de bases. Cosmídeos: são estruturas híbridas que possuem características do bacteriófago associadas à do plasmídeo pBR322, e são utilizadas para a clonagem dos maiores segmentos de DNA. Chromosomos artificiais para bactérias (BAC) e leveduras (YACs): podem ser usados para clonagem de fragmentos de DNA com centenas a milhões de pares de bases.

21 Plasmídeo pBR 322

22 Plasmídeo pUC 18

23 Bacteriófago

24 Plasmídeo para leveduras

25 Cosmídeos para leveduras

26 Cromossomo artificial para bactéria

27 Cromossomo artificial para leveduras

28 A tecnologia do DNA recombinante

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30 Cortar o DNA com enzimas de restrição
Fragmento 1 Fragmento 3 Fragmento 2 Fragmento 4 Inserir fragmentos em vetores Introduzir vetores em bactérias por: eletroporação ou choque térmico

31 Transformação bacteriana
Eletroporação Transformação bacteriana

32 Plaqueamento

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