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Diagnóstico Laboratorial Anemias Hereditárias Prof. Paulo Roberto de Melo Reis.

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2 Diagnóstico Laboratorial Anemias Hereditárias Prof. Paulo Roberto de Melo Reis

3 Conteúdo do eritrócito 250 a 350 milhões de moléculas de hemoglobina Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

4 Genética da hemoglobina Cadeia beta Cadeia alfa 141 aa 146 aa Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

5 Hemoglobinas fisiológicas A combinação de duas cadeias alfa ( ) com duas beta ( ) formam as hemoglobinas. Portanto, a hemoglobina tem estrutura tretamérica. 2 Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

6 Tipos de Hb após 6 meses de vida Tipos de HbComposiçãoConcentração A 2 96 – 98% A2A2 2 2 – 4% FETAL 2 0 – 1% Dados: Paulo César Naoum – Hemoglobinopatias e Talassemias Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

7 ANEMIA TRATAMENTO Avaliação entre 30 e 60 dias Responsiva Não responsiva Cura Refratária ao tratamento Anemia hereditária Talassemia ( alfa, beta) Hemoglobinopatia Anemia adquirida Sideroblástica Conduta terapêutica na anemia microcítica hipocrômica Ferro Normal e ferritina

8 Anemias Hereditárias É um grupo heterogêneo de distúrbios hereditários que ocorre por alterações gênicas dos cromossomos e que apresentam como conseqüência alterações de membrana, deficiência de produção enzimática e de preenchimento hemoglobínico do eritrócito, tanto qualitativa quanto quantitativamente. Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

9 Anemias Hereditárias A história familiar e descendência tomam caráter decisivo na elucidação das anemias hereditárias, em especial as hemoglobinopatias e talassemias. Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

10 Anemias Hereditárias Defeitos de membrana Esferocitose Ovalocitose Estomatocitose Defeitos metabólicos Piruvato quinase Pirimidina 5- nucleotidase G-6-FD Glutitiona redutase Defeitos na hemoglobina Síntese deficiente : Talassemia ; Variantes anormais : HbS, HbC Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

11 Prevalência de anemias hereditárias no Brasil Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

12 PRINCIPAIS TIPOS DE TALASSEMIAS TALASSEMIA ALFA TALASSEMIAS BETA TALASSEMIAS INTERATIVAS FENÓTIPOS TALASSÊMICOS Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

13 ORIGEM DAS TALASSEMIAS Talassemia alfa Ásia e áfrica Talassemia beta Mediterrâneo Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

14 Talassemia beta As talassemias beta ocorrem por falha do gene que sintetiza a globina beta, situados no cromossoma 11. A diminuição da globina beta prejudica sua associação com a globina alfa NORMAL TAL. BETA TAL. + TAL. 0 MENOR MAIOR MAIOR Definição Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

15 CLASSIFICAÇÃO CLÍNICA DAS TALASSEMIAS BETA HEMOGLOBINA (g/dl) 13 RETICULÓCITO ,5 - 2 ERITROBLASTO / ERITRÓCITOS / - ALTERADOS ICTERÍCIA / ESPLENOMEGALIA / ALTERAÇÕES + + +/ ESQUELÉTICAS NECESSIDADE DE / TRANSFUSÕES MAIOR INTERMÉDIA MENOR MÍNIMA Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

16 Talassemia Beta Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

17 Talassemia beta Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

18 Pontilhado basófilo Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

19 Talassemia beta Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

20 Talassemia Beta Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

21 TALASSEMIA ALFA CONSEQÜÊNCIAS da LESÃO GENÉTICA NO CROMOSSOMO 16 O DESEQUILÍBRIO /. Sobra cadeia que tetramerizam-se FORMANDO Hb H ( 4 ) Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

22 RESUMO DAS ALTERAÇÕES LABORATORIAIS ( ) Hb Fetal 0 - 1% Hb A 2 2,0 - 4% Hb A % Conseqüências da redução de síntese de cadeias alfa ALFA TALASSEMIA Traços de Hb H na eletroforese Precipitados de Hb H nos eritrócitos Discreta microcitose Anemia ( ) Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

23 RESUMO DAS ALTERAÇÕES LABORATORIAIS ( ) DOENÇA DE Hb H Hb H ( %) na eletroforese Precipitados de Hb H nos eritrócitos Anemia microcítica - hipocrômica (+, ++) HCM Hb A 2 Esplenomegalia Síndrome hidrópica (Hidropsia Fetal) Hb Barts % Hb H 10% Anemia eritroblástica (++++) Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

24 Talassemia alfa Relações laboratoriais MínimaMenorDoença da Hb H Hidropisia fetal VCM Hb <7 % Hb H Traços- 2% Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

25 Talassemia alfa Resumo: Hemoglobina H: Tetrâmero de cadeias beta Hb H = 4 Hemoglobina de Bart´s: Tetrâmero de cadeias gama Hb Bart´s = 4 Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

26 Talassemia alfa Hidropisia fetal Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

27 Hemoglobinas variantes É um grupo de anormalidades hereditárias em que a produção de hemoglobina normal é suprimida e substituída, parcial ou totalmente, pela formação de uma ou mais das muitas variantes hemoglobínicas. Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

28 Hemoglobina S É causada por uma mutação no gene beta da globina. Há substituição de um base nitrogenada do códon GAC para GTC, resultando na substituição do ácido glutâmico (Glu) pela valina (Val) na posição 6 da globina beta. Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

29 HISTÓRICO DA DOENÇA FALCIFORME CRUZ JOBIM (BR) LEBBY (USA) HODENPY (USA) 1908 – JESSE ACIOLY(BR) PACIENTES NEGROS COM ANEMIA GRAVE ICTERÍCIA DORES AGUDAS Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

30 Hemoglobina C É causada por uma mutação no gene beta da globina. Há substituição do ácido glutâmico (Glu) pela lisina (Lis) na posição 6 da globina beta. Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

31 CÉLULAS EM ALVO NA Hb C/TAL BETA Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

32 Hemoglobina D D Los Angeles o ác. glutâmico (Glu) é substituído pela glutamina (Gln) na posição 121 da globina beta. D Bushman A Glicina (Gli) é substituída pela arginina (Arg) na posição 16 da globina beta. Apresenta a mesma mobilidade eletroforética da Hb S OUTRAS Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

33 Hemoglobina E É causada por uma mutação no gene beta da globina. Há substituição do lisina (Lis) é substituída pelo ácido glutâmico (Glu) na posição 26 da globina beta. Tem mobilidade eletroforética ligeiramente a frente da Hb C – causando confusão. Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

34 HEMOGLOBINAS VARIANTES CERCA DE 400 TIPOS DIFERENTES SEM CONSEQUÊNCIAS PATOLÓGICAS. Ex. Hb N, Hb J, Hb G, Hb Porto Alegre APENAS Hb S E Hb C CAUSAM PATOLOGIA Hb S (SS, SC, SD, S/Tal) FALCIZAÇÃO DO ERITRÓCITO Hb C (SC, CC, S/Tal) CRISTALIZAÇÃO DA Hb

35 Métodos para diagnosticar hemoglobinopatias e talasemias Métodos auxiliares: 1.Resistência globular a salina 0,36% 2.Dosagem de Hb Fetal 3.Pesquisa de Hb Fetal 4.Teste de Falcização 5.Pesquisa de Talassemia Alfa (Hb H) 6.Pesquisa de Corpos de Heinz Métodos básicos: 1.Eletroforese Alcalina 2.Eletroforese Ácida 3.Dosagem de A 2 Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

36 Talassemias LABORATÓRIO ESPECÍFICO presença de Hb H: Tal. alfa aumento de Hb A 2 : tal. beta menor diminuição ou ausência de Hb A: tal. beta maior elevação > 20% de Hb fetal: tal. beta maior reticulocitose: anemias hemolíticas aumento de bilirrubina indireta: anemias hemolíticas Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

37 Triagem Interpretação: Deficiência de hemoglobinização Teste de resistência globular a salina 0,36% Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

38 Dosagem de Hemoglobina Fetal Método de: 1)Singer – concentrações 2)Betke - concetrações Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

39 Coloração intra-eritrocitária de Hemoglobina Fetal Método de Kleihauer e Betke (modificado por Shepard e cols., 1962) Princípio: A hemoglobina Fetal é acido-resistente e não sofre eluição. Cora-se pela eritrosina. As outras hemoglobinas são eluidas e não se coram pela eritrosina Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

40 Teste de falcização das hemácias Princípio: O metabisulfito de sódio reduz a tensão de oxigênio e fazendo com que hemoglobina S tome a forma característica de foice, ou de meia-lua. Metabissulfito de sódio a 2% Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

41 Pesquisa intra-eritrocitária Hemoglobina H Pesquisa intra-eritrocitária – Azul brilhante de cresil 100 ul sangue 200 ul ACB Incubar 2 horas Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

42 Talassemia alfa Hemoglobina H Pesquisa intra-eritrocitária – Azul brilhante de cresil Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

43 Corpos de Heinz Hemoglobinas instáveis Pesquisa intra-eritrocitária – Azul brilhante de cresil Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

44 Pesquisa intra-eritrocitária Hemoglobina H Corpos de Heinz Hemoglobinas instáveis 100 ul sangue 200 ul ACB Incubar 2 horas Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

45 Reticulócitos 100 ul sangue 100 ul ACB Incubar 30 minutos Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

46 Reticulócitos Azul brilhante de cresil Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

47 Comparação Hb H Corpos de Heinz Reticulócitos Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

48 Eletroforese Eletro = Eletricidade Forese = Separação Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

49 Eletroforese É a migração de partículas quando colocadas em campo elétrico. Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

50 Eletroforese çA migração indica o sinal da carga da partícula. çEste sinal será oposto ao do pólo para onde irá migrar. Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

51 Eletroforese de hemoglobina ACETATO DE CELULOSE: Preparação do hemolisado Tampão TRIS - pH=8,6 Padrão ( hemolisado controle) Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

52 Eletroforese de hemoglobina ACETATO DE CELULOSE: Preparação do hemolisado teste e padrão: 50 ul de sangue 100 ul de saponina a 1% Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

53 Eletroforese de hemoglobina ACETATO DE CELULOSE: A hemoglobina H é instável e os solventes usados para remoção do estroma das hemácias ( éter, clorofórmio, toluol, etc) desnaturam a Hb H Importante Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

54 - + A ACA2A HbH Eletroforese de Hemoglobina. Hemoglobina H Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

55 Eletroforese de hemoglobina Eletroforese em acetato de celulose – TEB pH=8,6 Hemolisado com saponina a 1%. Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

56 Talassemia alfa Detalhe Hb H Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

57 Eletroforese de Hemoglobina. Padrão normal - + Ap AC A2 A Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

58 ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS AP AC A2/C S/D F A PERFIL AA AS SS AC CC AF Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG Perfil eletroforético comparativo

59 Eletroforese de hemoglobina Eletroforese em acetado de celulose - Tampão TEB pH=8,6. Hemolisado com solução de saponina a 1%. SC AC AS SC AA Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

60 ELETROFORESE DE Hb BARTS E Hb H Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

61 ELETROFORESE DE Hb EM RN E ADULTO Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

62 ELETROFORESE DE Hb EMBRIONÁRIAS Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

63 HEMOGLOBINAS NORMAIS APÓS SEIS MESES DE VIDA Hb A96 a 98% Hb A 2 2 a 4% Hb Fetal 0 a 1% Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

64 VARIANTES RARAS NÃO PATOLÓGICAS Hb PORTO ALEGRE Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

65 VARIANTES RARAS NÃO PATOLÓGICAS Hb N BALTIMORE Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

66 VARIANTES RARAS NÃO PATOLÓGICAS Hb G FILADELFIA E Hb F TEXAS Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

67 MUTAÇÕES NAS REGIÕES EXTERNAS ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS EM ACETATO DE CELULOSE Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

68 MUTAÇÕES NAS REGIÕES EXTERNAS FAMÍLIA COM Hb C/TAL BETA Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

69 Eletroforese de hemoglobina Eletroforese em ágar ácido – fosfato pH=6,2 Hemolisado com saponina a 1%. Indicação: Diferenciar HBS da HBD-HBC da HBE Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

70 Padrão laboratorial Hemoglobina S HomozigóticaHeterozigótica HbS 89 a 99% 20 a 40% HbA Ausente 60 a 80% HbA 2 1,5 a 3% 1,5 a 3% HbF 1 a 2 % 1 a 2 % Hemoglobina C HbC 100 % 20 a 40 % HbA Ausente 60 a 80% HbF < 7% Ausente Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

71 Ordem de migração de algumas hemoglobinas - HbA 2 HbD e HbS HbL e HbP HbG HbQ HbF HbA HbM e HbK HbJ HbN Hb de Bart, HbI e HbH. + Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

72 Outras hemoglobinas HbG Norfolk Hb de Bart Hb Lepore Hb Porto Alegre Hb Gun Hill Hb Freiburg HbM Boston HbM Saskatoon HbM Iwate HbM Hyde Park HbF Texas HbF Roma Etc Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

73 Hemoglobinopatias HbD – Homozigoto HbD/HbD - Semelhante a HbS, porém, pela ausência do fenômeno drepanótico. O estigma HbA/HbD é assintomático. Ocorre: Índia e pequena % de negros nos EUA HbE – Homozigoto HbE/HbE. O estigma HbA/HbE é assintomático. Ocorre: Sudeste Asiático. HbS/HbC = 50% de cada. Prof. Paulo Roberto de Melo Reis-Biomedicina-UCG

74 Eletroforese Ap AC A2 /C S A Hb SS Hb CC Hb SC antes da transfusão

75 Eletroforese após a transfusão Ap AC A2 /C S A Hb SS Hb CC Hb SC


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