Daniel C. Carvalho(IC), Marco A. Romano-Silva,

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1 Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha Phoneutria nigriventer
Daniel C. Carvalho(IC), Marco A. Romano-Silva, Marco A. M.Prado, Marcus V. Gomez, Vania F. Prado e Evanguedes Kalapothakis Orientador: Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis Depto de Farmacologia - ICB - UFMG

2 Aranha armadeira Phoneutria nigriventer

3 Efeitos decorrentes da inoculação subcutânea do
veneno de P. nigriventer: Dor forte; Cãibras dolorosas; Tremores; Sudorese; Hipersecreção salivar; Priaprismo; Convulsões tônica; Morte. Efeitos semelhantes observados em seres humanos decorrente da picada da aranha.

4 Canal de sódio onde estão indicados sítos de ligação para Toxinas

5 Ø Ø Ù Ù Ù Ù Veneno PhTx1 PhTx2 PhTx3
(Rezende et al., 1991) Veneno PhTx PhTx PhTx3 Tx Tx2-1 Tx2-2 Tx Tx3-1 Tx3-2 Tx3-3 Tx2-4 Tx2-5 Tx Tx3-4 Tx3-5 Tx3-5 Tx2-7 Tx2-8 Tx2-9 Ø Ø Ù Ù Ù Ù (Diniz et al., 1990) (Cordeiro et al., 1992) (Cordeiro et al., 1992)

6 Sequência de aminoácidos das toxinas da aranha Phoneutria nigriventer:
Tx1 AELTSCFPVGHE-CDGDASNCNCCGDDVY----CGCGWGRWN----CKCKVADQSYAYGICKDKVNC Tx ATCAGQDKP-CKET---CDCCGERGE----CVCALSYEGKYR-CICRQGNFLIAWHKLASCK Tx ATCAGQDQT-CKVT---CDCCGERGE----CVCGGP CICRQGNFLIAAYKLASCKCK Tx ATCAGQDQP-CKET---CDCCGERGE----CVCGGP CICRQGYFWIAWYKLANCKK Tx SFCIP-FKP-CKSDEN---CCKKFK-----CK-TTGIVK-----LCRW Tx AECAA-VYERCGKGYKR--CC-EERP----CKCNIVMDN----CTCKKFISE Tx ACAG-LYKKCGKGASP--CC-EDRP----CKCDLAMGN----CICK Tx GCAN-AYKSC-NGPHT--CCWGYNGYKKACICSG?NWK Tx SCIN-VGDFC-DGKKD--CCQCDRDNAF-CSCSVIFGYKTN-CRCE Tx GCIG-RNESCKFDRHG--CCWPW-----CCSCCKCGQPESDVG Tx ACIP-RGEICTDD---CECCGCDNQ----CYCPPGSSLGIFKCSCAHANKYFCNRKKECKKA Sequência de aminoácidos das toxinas da aranha Phoneutria nigriventer:

7 Objetivo Identificar e clonar neurotoxinas da glândula
de veneno da aranha Phoneutria nigriventer relacionadas a fração PHTx2. Subclonar as toxinas em vetores de expressão procariotos e eucariotos (pMAL). Estudar o efeito de cada toxina recombinate.

8 Sonda Radiotiva t c g c t c a c g t c g c t c g c g aggagagaactaatt ttgggaa Pn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat DNA polimerase

9 Dot Blot - Biblioteca de cDNA
Pré-hibrização Hibridização Pré-hibrização Hibridização Sonda radioativa Pn2-5A cDNA

10 Dot Blot controle Controle Positivo Controle positivo

11 Dot Blot da Biblioteca de cDNA
sonda Pn2-5A

12 Pn2-5A/Pn2-5B B11-1 bcacgagtgtggacatatctcgatacaactcaga
Pn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat B11-1 ATG AAA GTT GCA ATC CTC TTC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA TCC ATT Pn2-5A B11-1 GAA GAA TCC CGT GAT GAT TTT GCT GTA GAA GAA CTG GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA Pn2-5A G T T ... B11-1 GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AAA GGA GAA TGT GTT TGC GGA Pn2-5A A G .T G T ..A B11-1 GGA CCT TGC ATT TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AGC TGT Pn2-5A A T B11-1 AAG AAA tga-atggatttatgtattccacgatataataaatattgttgcatttgaaaaaaaaaaaaaaaaaa Pn2-5a t a...g a

13 * * * * * * * * * * * * * AM 848 ATG AAA GTC GCA ATC CTC ATC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA ACC ATT GAA GAA TAC CGT GAC GAT TTT GTT GTA GAA GAA TTG B T T T C T C C.. B T T T C T N C.. AM C B T C B N T C. ..N T B T C N.. ... B S T C B T T.N T * * * * * * * * * * * * * AM 848 GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AGA GGA GAA TGT GTT TGC GGA GGA CCT TGC ATT B XB B AM N N N N. A.A .N. ... N B B B N N.N .N B STN B N * * * * * * * * * * * * * AM848 TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AAC TGT AAA AAA TGA TAT GGA TTT ATG TAT B G. .G. ..G B AM N B G G .H B G G B N N B G G CC ACG ATA TAA TAA B G G N.. * * * * * * * * AM848 ACC ACG ATA TAA TAA ATA TTA TTG CAT TTG AAA AAA AAA AAA AAA B T G B T G N AM N G GGG GGG GGG GGG B T G B T G B T.. N G ... .N GN NGG B ATA TTG TTG C.T .TG .A. AA. AAA A.A AAA B T N .N. N.G

14 Tx2-5 ATCAGQDQTCKVTCDCCGERGECVCGGPCICRQGNFLIAAYKLASCKCK*
PEPTÍDEO SINAL PRÓ-PEPTÍDEO TOXINA MADURA Tx ATCAGQDQTCKVTCDCCGERGECVCGGPCICRQGNFLIAAYKLASCKCK* Pn2-5A MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFAVEELGR ATCAGQDQTCKVTCDCCGERGECVCGGPCICRQGNFLIAWYKLASCKK* B MKVXILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEELER ATCXGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK* B MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKX* B MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFAVEELER ATCXGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK* AM MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFAV*ELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK* AM MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFVX*ELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVXGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK* AM MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFXVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK* AM MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFVVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK* AM MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEXLXR ATCAGQDQPCKXTCDXCXKXGXCVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKKX AM MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEXLER ATCAGQDQPCKXTCDCCGXXGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLAXCXK* AM MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRGXFAVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWI Pn4A MKVAIVFLSLLVLAFA SESIEENREEFPVEESAR CADINGACKSDCD---CCGDSVTCDCYWSDSCKCRESNFKIGMAIRKKFC AM MKVAIVFLSLXVLAFA SESIEENREEFPXF*SAR CXDINGACKSDCD---CCGDSVTCDCYWSXSCKCXESNFKIGMAIXKKFX* AM MKVAIVFLSLLVLAFX XESIEENREEFPVEESAR CGDINAACKEEAAIV

15 PERSPECTIVAS Clonagem e sequenciamento de novas toxinas
Expressão das toxinas recombinantes; Ensaios farmacológicos e eletrofisiológicos com as toxinas recombinanates.

16 PCR de colônia bactériana com pMALc2 + B11-1

17 Divisão Biologia Celular
Profs.: Dr. Evanguedes Kalapothakis Dr. Luiz A. C. DeMarco Dr. Marcus V. Gomez Dr. Marco A. M. Prado Dr. Marco A. Romano-Silva Neurobiologia Molecular Profa.: Dra. Vania F. Prado

18 PCR de colônia bactériana pMAL+ pMALp2
Primers Pn2-5F e Pn2-5R

19 Pn2-5A/Pn2-5B Pn2-5B bcacgagtgtggacatatctcgatacaactcaga Pn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat Pn2-5B ATG AAA GTT GCA ATC CTC TTC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA TCC ATT Pn2-5A Pn2-5B GAA GAA TCC CGT GAT GAT TTT GCT GTA GAA GAA CTG GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA Pn2-5A G T T ... Pn2-5B GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AAA GGA GAA TGT GTT TGC GGA Pn2-5A A G .T G T ..A Pn2-5B GGA CCT TGC ATT TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AGC TGT Pn2-5A A T Pn2-5b AAG AAA tga-atggatttatgtattccacgatataataaatattgttgcatttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Pn2-5a t a...g a Sequência de nucleotídeos do cDNA das isoformas Pn2-5a e Pn2-5b. As regiões não trasncritas estão em azul, a toxina esta destacada em verde e ainda o codon de iniciação, terminação e a região de poliadenilação em vermelho.