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Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood Tomohiro Kono, Yayoi Obata, Quiong Wu, Katsutoshi Niwa, Yukiko Ono, Yuji Yamamoto, Eun Sung.

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2 Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood Tomohiro Kono, Yayoi Obata, Quiong Wu, Katsutoshi Niwa, Yukiko Ono, Yuji Yamamoto, Eun Sung Park, Jeong-Sun Seo & Hidehiko Ogawa Nature - vol 428 – 22 april 2004

3 Porque não ocorre partenogênese em mamíferos? IMPRINTING

4 Função de cada um Embrião Embrião Somente com cromossomos maternos: Somente com cromossomos maternos: Tecidos extraembrionários se desenvolvem pouco Tecidos extraembrionários se desenvolvem pouco Somente com cromossomos paternos: Somente com cromossomos paternos: Desenvolvimento do embrião é retardado Desenvolvimento do embrião é retardado Expressão Gênica Diferencial

5 Genes Igf2 e H19 Cópia materna - expressa H19 Cópia materna - expressa H19 Cópia paterna - expressa Igf2 Cópia paterna - expressa Igf2 DMD: differentially methylated domain DMD: differentially methylated domain Está entre os dois genes, acima do gene H19 Está entre os dois genes, acima do gene H19 Coopera com acentuadores abaixo do gene H19 Coopera com acentuadores abaixo do gene H19 Cópia materna: CTCF se liga a DMD Cópia materna: CTCF se liga a DMD Cópia paterna: DMD metilado – ligação impedida Cópia paterna: DMD metilado – ligação impedida

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8 Kono e colaboradores Cromossomos de óvulo imaturo (ng WT ) sem imprintings Cromossomos de óvulo maduro (fg WT ) Embriões partenogenéticos (13,5 dias de feto)

9 Partenogênese X Genes H19 e Igf2 Cromossomos de óvulo imaturo (ng) Cromossomos de óvulo imaturo (ng H19Δ3 ) sem uma região de 3Kb (gene H19) Cromossomos de óvulo maduro (fg WT ) Embriões partenogenéticos (17,5 dias de gestação)

10 Partenogênese X Genes H19 e Igf2 + DMD Cromossomos de óvulo imaturo(ng) Cromossomos de óvulo imaturo(ng H19Δ13 ) sem região do gene H19 e do DMD Cromossomos de óvulo maduro (fg WT )

11 Table 1 Development of reconstructed parthenogenetic embryos Developmental progress Number Number of reconstructed eggs457 Number of embryos developed to Blastocysts 417 (91.2% of reconstructed eggs) Number of embryos transferred371 (89.0% of blastocysts) Number pregnants/recipients24/26 Number of implantation to recipients 246 (71.7% of embryos transferred to pregnants) Number of pups 28 (8.2% of embryos transferred to pregnants) Dead 18 (5.2% of embryos transferred to pregnants) Live 8 (2.3% of embryos transferred to pregnants) Survived 2 (0.6% of embryos transferred to pregnants)

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14 Análise de expressão gênica global Microarray de embriões com 12,5 dias de gestação Microarray de embriões com 12,5 dias de gestação Controle, ng WT /fg WT e ng/fg WT Controle, ng WT /fg WT e ng H19Δ13 /fg WT Fenótipos similares com o controle mas pesos da placenta e do feto inferior aos do controles Fenótipos similares com o controle mas pesos da placenta e do feto inferior aos do controles Não houve diferença significativa na proporção de embriões g WT /fg WT (25%) e ng/fg WT (35%). Não houve diferença significativa na proporção de embriões g WT /fg WT (25%) e ng H19Δ13 /fg WT (35%).

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16 Análise de expressão gênica global O padrão de expressão gênica dos embriões ng/fg WT diferiu em uma grande variedade de genes quando comparados com embriões ng WT /fg WT. Foram 1038 genes distribuídos: O padrão de expressão gênica dos embriões ng H19Δ13 /fg WT diferiu em uma grande variedade de genes quando comparados com embriões ng WT /fg WT. Foram 1038 genes distribuídos: 15,1% comunicação celular 15,1% comunicação celular 19,1% manutenção/crescimento celular 19,1% manutenção/crescimento celular 21,9% metabolismo 21,9% metabolismo

17 Dentre os 34 genes com imprinting: Dentre os 34 genes com imprinting: ng/fg WT ng H19Δ13 /fg WT Grb10 (mantém comportamento de F m F m, 2 cópias ligadas) Grb10 (mantém comportamento de F m F m, 2 cópias ligadas) Upregulated mais do que o dobro dos níveis de controle. Upregulated mais do que o dobro dos níveis de controle. Nnat (F m F m, tem 2 cópias desligadas) Nnat (F m F m, tem 2 cópias desligadas) Downregulated menos que a metade dos níveis de controle. Downregulated menos que a metade dos níveis de controle. ng WT /fg WT ng WT /fg WT 11 genes são downregulated (F m F m, 2 cópias desligadas) 11 genes são downregulated (F m F m, 2 cópias desligadas) Grb10 é upregulated no ng WT /fg WT (F m F m, ligados) Grb10 é upregulated no ng WT /fg WT (F m F m, ligados)

18 Expressão diferencial significativa Expressão diferencial significativa Entre 11 e 42 (média 30) genes nos ng/fg WT Entre 11 e 42 (média 30) genes nos ng H19Δ13 /fg WT Somente o gene Dlk1 mudou sua expressão nos 4 embriões ng/fg WT Somente o gene Dlk1 mudou sua expressão nos 4 embriões ng H19Δ13 /fg WT Entre 431 e 1324 (média 842) genes ng WT /fg WT Entre 431 e 1324 (média 842) genes ng WT /fg WT 329 genes com expressão diferenciadas nesses embriões (todos eles) 329 genes com expressão diferenciadas nesses embriões (todos eles)

19 Quais genes seriam responsáveis pela sobrevivência dos embriões partenogenéticos? Igf2 Igf2 H19Passam a ter imprinting H19Passam a ter imprinting Dlk1 durante a espermatogênese Dlk1 durante a espermatogênese Gtl2 Gtl2 Análise de expressão gênica quantitativa : Real time PCR Análise de expressão gênica quantitativa : Real time PCR

20 Igf2Expressos no Igf2Expressos no H19mesmo nível em ng/fg WT H19mesmo nível em ng H19Δ13 /fg WT Dlk1 (pulmões, coração e músculo) Dlk1 (pulmões, coração e músculo) ng/fg WT somente no músculo e pulmões (coração OK...) ng H19Δ13 /fg WT somente no músculo e pulmões (coração OK...) Nos embriões com crescimento retardado a expressão no pulmão foi reprimida também = causa da morte? Nos embriões com crescimento retardado a expressão no pulmão foi reprimida também = causa da morte? Gtl2 Gtl2 Em embriões com crescimento retardado tiveram níveis de expressão 2 a 4 vezes maiores que o controle Em embriões com crescimento retardado tiveram níveis de expressão 2 a 4 vezes maiores que o controle Normalmente tem expressão bilateral (dados recentes) Normalmente tem expressão bilateral (dados recentes) Resultados Os dois genes devem ter tido expressão normal nos partenotos que sobreviveram

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22 Conclusão Imprinting é uma barreira para desenvolvimento partenogenético em camundongos Imprinting é uma barreira para desenvolvimento partenogenético em camundongos Hipótese do conflito parental Hipótese do conflito parental Expressão apropriada de Igf2 e H19 causa modificação em uma grande variedade de genes e no desenvolvimento normal em camundongos partenogenéticos ng/fg WT. Expressão apropriada de Igf2 e H19 causa modificação em uma grande variedade de genes e no desenvolvimento normal em camundongos partenogenéticos ng H19Δ13 /fg WT.


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