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A resposta da checagem de danos no DNA telomérico em células senescentes Juliana Roriz Aarestrup.

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1 A resposta da checagem de danos no DNA telomérico em células senescentes Juliana Roriz Aarestrup

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3 INTRODUÇÃO HDFs Senescência em fibroblastos humanos diplóides primários O que é senescência?

4 Checagem de danos no DNA

5 MATERIAL E MÉTODOS Cultura celular:Cultura celular: MCR5 e BJ em DMEM + soro bovino fetal = senescência (após 3 semanas) MCR5 e BJ irradiadas, fixadas, incubadas com anticorpos secundários

6 Imunoblotting:Imunoblotting: Extração Tampão TEB150 + lisina ou gel de poliacrilamida DNA microarray:DNA microarray: Clones DNA total Intervalos de 1Mb. Ps: para cromossomo 22 = 447 clones Isolamento e amplificação dos fragmentos DOP-PCR

7 Marcação do DNA, hibridização e análise:Marcação do DNA, hibridização e análise: Escaneamento marcação (fluorescência) hibridização (Dye- label-reverse) Anticorpos:Anti-Anticorpos: Anti- -H2AX, CHK1, pS/TQ, CHK1, CHK1pS345, CHK2, CHK2pT68, p53pS15, NBS1, SMC1pS966, SMC1, PML, RAD17, H2A, p21, TRF1, TRF2, Flag, MDC1, RAD1, RAD17pS645, MCM7, 53BP1

8 Plasmídios:Plasmídios: pCHK2-KD Gerado por PCR de ORF de CHK2 pH2B-YPF Histona H2B pATM-KD pATR-KD pCHK1-KD

9 Microinjeção:Microinjeção: Células placas com poli-L-lisina incubação em meio Nut Mix F-12 + soro de bovino recém-nascido Plasmídio + pH2b-YFP Microinjeção em células senecentes SiRNA:SiRNA: Síntese e transferência por oligofectamine

10 RESULTADOS E DISCUSSÃO

11 Figura 1 - Resposta a danos no DNA em células senescentes Foci -H2AX e 53BP1

12 Quantificação de -H2AX e 53BP1 H2AX foi corada com anticorpos monoclonais de camundongo ou anticorpos policlonais de coelho. Histogramas: % de céls. Com, no mínimo um focus detectável em recente proliferação celular, células quiescentes, senescentes e telomerizadas

13 e-i: Fibroblastos senescentes com Foci 53BP1, pS/TQ, MDC1, NBS1, SMCpS966, co-localizados com foci -H2AX j-n: Extratos completos de céls. Irradiadas, não- irradiadas, quiescentes, senescentes e telomerizadas

14 Figura 2- Associação direta de terminações cromossômicas a Figura 2- Associação direta de terminações cromossômicas a -H2AX Array de clonse de DNA p/ cromososmo 22q

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16 Eixo Y:Diferença entre os raios de imunoprecipitação versus DNA input de céls. Senescentes e quiescentes. Eixo X: Distância em Mb Em vermelho: Clones de regiões enriquecidas em imunoprecipitados Em preto: Clones que retratam o raio de diferença inferior a 99%

17 Figura 3- Resposta a danos no DNA telomérico Fibroblastos humanos imortalizados (T19) foram induzidos a expressar TRF2 B M por até 8 dias TRF2 B M a- Expressão induzida de Flag- TRF2 B M b- Acúmulo progressivo de-H2AX c- Fosforilação progressiva de SMC1 em S966

18 d- Fosforilação progressiva de RAD17 em S645 e- Fosforilação CHK1 em S345 f- Fosforilação CHK2 em T68 Asterisco: Banda específica

19 Análise por Ch1ps B M por associação de antígenos a DNA telomérico Indução de TRF2 B M por associação de antígenos a DNA telomérico

20 Figura 4- Checagem da inativação em células senescentes Figura 4- Checagem da inativação em células senescentes Indução da progressão da fase S Eixo Y: % de células Bj senescentes BrdU- positivas, microinjetadas com plasmídios expressando alelos dominante-negativos de quinases de checagem de danos no DNA ou vetores completos.

21 CONCLUSÃO Céls. Somáticas: Número limitado de duplicações in vitro; Senescência: Telômero funções anormais. A resposta a danos no DNA em céls. senescentes deve ocorrer em virtude de uma disfunção telomérica ou por geração de cromossomos dicêntricos; Marcadores moleculares ativos próximos a quebras de DNA: H2AX, 53BP1, MDC1, NBS1, CHK1, CHK2;

22 Telômero Contribuição direta na resposta a danos de DNA em células senescentes; Inativação de quinases = indução do sistema checkpoint em céls. senescentes = Progresso da fase S;

23 Este modelo explica porque a radiação ionizante e outros agentes levam a uma permanente estagnação do ciclo celular em HDFs. Assim, pode ser de relevância para mecanismos tumorais.

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