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PublicouÂngelo Belo Alterado mais de 10 anos atrás
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Acute mutation of retinoblastoma gene function is sufficient for cell cycle re-entry Julien Sage, Abigail L. Miller, Pedro A. Pérez-Mancera, Julianne M. Wysocki & Tyler Jacks Henrique C. De Paoli Orientador: Dr. J. Miguel Ortega
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Modelo da Inativação de Rb EXON3 Cél. Tronco MEFs cRb lox/lox Rb/cond cond/cond (normal)
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MEFs cRb lox/lox Taxa de proliferação normal Expressão de Rb normal Vetor Adeno Cre Infecta TODAS as células 24 hrs EXON 3
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GenemRNAProteína Rb 3 dias p130 Normal p107 Aumentada Rb -/- nocaute MEFs: p107 aumentada Adeno não muda proliferação wt, Rb -/-, Rb lox/lox
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ENTÃO: Rb -/- cRb lox/lox + Cre cRb -/- Mesma proliferação!!! Param em confluência com a mesma densidade!!! ? Elas ficam quiescentes? (G 0 ) - soro G 0 (quiescente)
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Confluência :10%SF 3 dias em 0,1%SF Tripsiniza (separa) G 0 Adeno 0,1%SF 3 dias 0,1% SF +BdUr por 24hrs Alguém está em fase ? Adeno normal (MOCK) Adeno Cre 1º Experimento: Rb -/- Não previne de entrar em G 0 (80%) cRb lox/lox 90% em G 0 cRb -/- (cre)50% em G 0 Nocaute Rb -/- entra MELHOR em G 0 20% Perda Aguda cRb -/- entra PIOR em G 0 50% Compensação durante o desenvolvimento?
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cRb lox/lox p21 p16 alvosE2F (CiclinaE, MCM6) p107 p19 p130 cRb -/- p21 p16 alvosE2F p107 p19 p130 ============ = Nocaute (Rb -/- ) Este para em G 0 ! Alguém está compensando a falta de Rb aqui? Logo, não pode ser isso!
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Será que é a p107 que faz a Rb -/- entrar em G 0 ? Rb -/- RNAi contra p107 (p130 OK!) 10%SF0,1%SF Mock 100%20% si-p107 100%70% Logo, é isso! Vamos fazer uma cultura só com cél. quiescentes! Observou-se que a maioria morria por falta da Rb e p107! Logo: Usa-se Lentivírus pq infecta apenas cél que não estão em divisão! Protocolo de 6 dias 3x BdUr
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E RNAi para p19? E na cRb lox/lox cRb -/- ? A p107 teria que subir muito rápido para compensar a perda de Rb! Logo, infecta com Adeno no dia -6, Rb, ficando sem soro, e: => deu tempo de p107 subir (similar à Rb -/- ) => entrou em G 0
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Senescência Rb -/- fica senescente Sem Rb, Sem p107, sem p130 => Não fica Mais um caso de sobreposição Só que... Mutação em Rb é que dá câncer!!! Rb -/- senescente p107 Rb lox/lox senescente p107 cRb lox/lox senescente + Adeno Cre cRb -/- 3 dias BdUr 24hrs Ad Mock: 10-20% Ad Acre: 50% H-ras
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cRb lox/lox Ad Ad Cre 298 27 73 3 dias (Mitose) Pode completar o ciclo (não só BdUr) Injetar anti-corpos contra p53 reverte a senescência, temporariamente. cRb -/- pode se dividir várias vezes?
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cRb lox/lox Senescente Ad Ad+Cre => 14 / 16 proliferaram LV+Cre => proliferaram Devolve Rb e retorna à senescência! (not shown)
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Conclusão: Os diferentes membros da familia Rb (p107 e p 130) sao igualmente capazes de induzir e manter o estado de senescencia A analise de Rb -/- pos-senescente mostrou que os marcadores associados a senescencia sao dependentes da funcao de Rb, controlando assim alguns aspectos do programa de senescencia A parada no ciclo celular induzido pela senescencia nao e um processo irreversivel.
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Para ocorrer a compensacao funcional de Rb e preciso uma ausencia mais prolongada de pRb e um reset mais complexo da maquinaria do ciclo celular. Por esta razao, a perda aguda de Rb pode, por si so, estimular a re-entrada no ciclo celular das celulas quiescentes (G 0 ) e senescentes (envelhecidas).
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