Desenho de primer e otimizações de PCR Éderson Kido

Apresentação em tema: "Desenho de primer e otimizações de PCR Éderson Kido"— Transcrição da apresentação:

1 Desenho de primer e otimizações de PCR Éderson Kido
Com base em Molecular Biology Techniques Manual

2 Fatores que afetam a PCR
Temperatura de denaturação Se o ácido nuclêico é aquecido em tampão de força iônica < 150 mM de NaCl, a temperatura de denaturação fica < 100oC. Logo, a PCR trabalha entre 91-97oC. A meia-vida da Taq Pol a 95oC é ~30min. Logo, o número de ciclos não supera muito em 30.

3 Temperatura de denaturação
Diminui após ~10 ciclos, pois o tamanho médio do DNA alvo também decresce. moldes menores de 300bp (50% de CG) tem temperatura de denaturação de 88oC. Tempo de permanência: denaturação da Taq. Em geral: 94oC – 1min. Se reduzir o tempo, maior número de ciclos é possível. Se aumentar a temperatura, diminua o tempo.

4 Temperatura de anelamento (Ta)
Depende do tamanho e composição dos primers. ~5oC abaixo do menor Tm do par de primers. Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC Se Ta for muito baixo, primers podem anelar em alvos similares e amplificar produtos não específicos. Se Ta for alto demais, a probabilidade do anelamento diminui e a quantidade de produto também.

5 Temperatura de anelamento
Maioria dos primers anelam em menos de 30 s, a não ser que Ta seja muito próximo do Tm ou primers muito longo.

6 Tamanho do primer Geralmente de 18 – 22 bases
Seqüência de 16 bases: estatisticamente -> uma vez em cada 416 bases (~4 bilhões bases; ~ tamanho do genoma humano ou do milho). Assim, seqüências maiores que 17 são específicas!

7 Primers degenerados Primers com opções em diferentes locais
Amplificação de seqüências relacionadas em diferentes organismos . TCGAATTCNCCYAAYTGNCCNT where Y = T + C, and N = A + G + C + T, Degeneração diminui a especificidade dos primers, aumenta ocorrência de mismatches e background. Base deoxiinosina pareia com qualquer base.

8 Primers derivados de alinhamentos múltiplos

9 Temperatura de elongação
Elongação ocorre a partir da temperatura de anelamento. Em ~70oC, a extensão ocorre com ~100 bases/s (1 min é suficiente para produto de 2 kb; para 3 kb, até 3 min). Normalmente 70-72oC, por 30s a 3 min.

10 Reação de PCR Tampão de PCR: Modernos são proprietários
10-50 mM Tris-HCl pH 8.3, até 50 mM KCl, >1.5mM MgCl2, primers 0.2 – 1 uM (cada), 50 – 200 uM (dNTP, cada) BSA até 100 ug/ml, Detergente não-iônico: Tween-20 ou Triton X-100 ( % v/v; previne agregação da enzima) Modernos são proprietários

11 Considerações PCR trabalha bem com tampão da transcriptase reversa: logo, síntese de cDNA com posterior PCR. > 50 mM de KCl ou NaCl inibe a Taq, mas presença auxilia no anelamento. [Mg2+] afeta anelamento, especificidade do produto, atividade enzimática... Primers, dNTPs e moldes quelam e seqüestram o íon. De 0,5 a 2,5 mM > [dNTP]. Primers: <1 uM (a menos que sejam degenerados); geralmente 0,2 uM. Nucleotídeos: ~50 mM (longos produtos exigem mais).

12 Número de ciclos Depende da concentração do DNA alvo.
40-45 ciclos amplificam 50 moléculas alvos até [ ] igual a ciclos, com 3x105 moléculas. Se o produto não for feito em 30 ciclos, reamplificar (20-30 ciclos) 1 uL, com novo mix.

13 Efeito plateau Atenua o acúmulo do produto, qdo este atinge de 0,3 a 1nM. Devido: degradação de enzima; depleção de dNTPs, primers; inibição pelo produto; competição por produtos não específicos; re-anelamento, etc

14 PCR1 detecta a partir de 1000 moléculas; PCR2 detecta a partir de 1.
Nested PCR PCR1 detecta a partir de 1000 moléculas; PCR2 detecta a partir de 1.

15 Primer design Tamanho: 17-28 bases; Composição: 50% (C+G);
Deveria terminar (3´) em G ou C; Tm entre 50-80oC; Três ou mais Gs ou Cs (3´) podem causar mispriming em regiões ricas em G ou C (evitar); Evitar primers com complementaridade de bases (dímeros de primers); Evitar complementaridade de bases em mesmo primer (haipin, estruturas secundárias)

16 Problemas