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Terapia genética no controlo da dor crónica Serviço de Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Orientadoras Dra.

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Apresentação em tema: "Terapia genética no controlo da dor crónica Serviço de Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Orientadoras Dra."— Transcrição da apresentação:

1 Terapia genética no controlo da dor crónica Serviço de Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Orientadoras Dra. Isabel Martins e Prof. Isaura Tavares Francisca Santos Nilza Pinto Maio 2005 Porto

2 «An unpleasant sensory and emotional experience which we primarily associate with tissue damage or describe in terms of tissue damage, or both» (IASP)

3 Sistema endógeno de controlo da dor

4 Um dos tratamentos mais utilizados no alívio da dor crónica são opiáceos como a morfina e compostos similares. efeitos colaterais efeitos colaterais habituação habituação

5 Terapia genética tratamento alternativo

6 Tecnologia cujo objectivo é corrigir a expressão de genes alvo implicados no desenvolvimento de doenças: Tecnologia cujo objectivo é corrigir a expressão de genes alvo implicados no desenvolvimento de doenças: - Sobre-expressar esse gene alvo - Ou diminuir a sua expressão Através do uso de vectores que transportam o gene terapêutico até às células-alvo.

7 Tipos de vectores: víricos e não víricos Os mais utilizados são os víricos Os vectores víricos são derivados de vírus por substituição da componente patogénica por genes terapêuticos. Penetram naturalmente nas células

8 Terapia genética da dor Fink et al., apresentado ao NIH Utilização de vectores víricos que promovem a libertação de opiáceos na medula espinhal Pohl et al., 2003

9 Fink et al., apresentado ao NIH Terapia genética da dor Utilização de vectores víricos que promovem a libertação de opiáceos na medula espinhal

10 Outros alvos: Regiões do encéfalo que controlam a transmissão da dor na medula a partir de determinadas estruturas do bolbo raquidiano VLM Bolbo raquidiano ventrolateral antinociceptivo

11 Injecção do HSV-1 (Herpes Simplex Virus -1) VLM activar os neurónios antinociceptivos do VLM

12 ICP4 hCMV-PPA lacZ TK ULUS Delecção do gene ICP4 Inserção da cassete (promotor de citomegalovírus e transgene) no gene da timidine kinase Transgene lacZ: beta galactosidase detectada por imunocitoquímica Construção do vector Não replicativo

13 - Os estudos de marcação retrógrada com traçadores neuroanatómicos mostraram que os corpos celulares dos neurónios aferentes ao VLM ocorriam no encéfalo e na medula espinhal Mas, com o HSV-1 só se observaram corpos celulares que exprimiam a beta-galactosidase em alguns núcleos do encéfalo. Não foram detectados corpos celulares na medula espinhal Mas, com o HSV-1 só se observaram corpos celulares que exprimiam a beta-galactosidase em alguns núcleos do encéfalo. Não foram detectados corpos celulares na medula espinhal Com base em estudos prévios: SELECTIVIDADE DE MIGRAÇÃO? - O HSV-1 tem grande afinidade pelos neurónios e migra retrogradamente do terminal axonal até ao corpo celular - O HSV-1 tem grande afinidade pelos neurónios e migra retrogradamente do terminal axonal até ao corpo celular

14 Objectivo do trabalho Detectar o DNA do vector para concluir sobre a sua migração Detectar o DNA do vector para concluir sobre a sua migração Tentou-se encontrar o genoma vírico na medula espinhal por PCR

15 Metodologia Injecção estereotáxica do vector no VLMInjecção estereotáxica do vector no VLM Sacrifício por decapitação (10 dias após injecção) Sacrifício por decapitação (10 dias após injecção) Dissecção: Dissecção: 1) Bolbo raquidiano (imunocitoquímica) 1) Bolbo raquidiano (imunocitoquímica) 2) Medulas (DNA) 2) Medulas (DNA) Medulas: Bolbos: Extracção de DNA Cortes de congelação Extracção de DNA Cortes de congelação PCR Imunocitoquímica PCR Imunocitoquímica Electroforese Electroforese

16 Injecção estereotáxica do vector

17 - Com a suspensão vírica n=4 - Com soro fisiológico n=1

18 Dissecção do bolbo e medula Decapitação 10 dias após injecção Decapitação 10 dias após injecção Dissecção Dissecção Rato C+ e C-: bolbo congelado a – 80ºC Rato C+ e C-: bolbo congelado a – 80ºC Restantes: Restantes: – bolbo fixador (paraformaldeído 4% - 4h- sacarose 30%) – medula espinhal (alargamentos cervical e torácico) congeladas a -80ºC

19 Reacção imunocitoquímica de detecção da beta-galactosidase Metodologia Metodologia –A) Cortes finos (40µm) no micrótomo de congelação dos bolbos fixados –B) Reacção imunocitoquímica Objectivo: verificar local de injecção Objectivo: verificar local de injecção

20 Beta-galactosidase Anticorpo secundário Anticorpo primário

21 Extracção de DNA Objectivo : Extracção de DNA para posterior amplificação por PCRObjectivo : Extracção de DNA para posterior amplificação por PCR MaterialMaterial Bolbos dos C+ e C-Bolbos dos C+ e C- Medulas dos animais com injecção no VLMMedulas dos animais com injecção no VLM MetodologiaMetodologia - Digestão com proteinase K - Digestão com proteinase K - Precipitação das proteínas - Precipitação do DNA com isopropanol - Ressuspensão do DNA em 20µl de água bi-destilada - Quantificação do DNA pela leitura da densidade óptica a 260nm

22 PCR Princípio da técnica : O PCR (PCR - Polymerase Chain Reaction) permite seleccionar e amplificar sequências específicas de uma cadeia de DNA graças à utilização de oligonucleotídeos : primersPrincípio da técnica : O PCR (PCR - Polymerase Chain Reaction) permite seleccionar e amplificar sequências específicas de uma cadeia de DNA graças à utilização de oligonucleotídeos : primers Vários protocolosVários protocolos –Primers para amplificar o transgene lacZ da construção vírica 95ºC- 45 sec95ºC- 45 sec 60ºC- 30 sec60ºC- 30 sec 72ºC -45 sec72ºC -45 sec 30 ciclos30 ciclos –Primers para amplificar o gene da timidina kinase do HSV-1 Optimizar o protocoloOptimizar o protocolo

23 Electroforese Gel de agarose a 2%Gel de agarose a 2% Visualização das bandas de DNA depois à adição de brometo de etídioVisualização das bandas de DNA depois à adição de brometo de etídio

24 Resultados - Reacção imunocitoquímica : local de injecção Os ratos cujo local de injecção estava no VLM foram utilizados para amplificação do DNA vírico na medula

25 ICP4 TK UL US hCMV-PPA lacZ ICP4 LR Amplificação do gene lacZ no alargamento torácico da medula espinhal Branco Controlo- Controlo+ Rato1Rato2 Rato3 200pb

26 Amplificação do gene da TK nos segmentos torácicos da medula espinhal hCMV-PPA lacZ TK LR 300pb A Optimização do protocolo DNA do controlo+ 1)Temperatura de annealing a 60 e 62ºC 2)Concentração de MgCl2 (cofactor da Taq Polimerase) a A:2,5mM e B:4mM 3)Betaina optimiza condições de PCR estabilizando o DNA 4)Condições escolhidas Temperatura de annealing 60ºC -2,5mM de MgCl 2 95ºC-45sec 60ºC-30sec 72ºC-45sec 30 ciclos BBA 60ºC62ºC

27 300pb Branco Controlo- Controlo+ Rato1Rato2 Rato3 300pb Amplificação do gene da TK nos segmentos cervicais e torácicos da medula espinhal Alargamento cervical Alargamento torácico Mesma quantidade de DNA total por amostra:5000ng/microg Diferenças de quantidade de DNA vírico no alargamento cervical e torácico

28 Perspectivas futuras: 1- Questão técnica: quantificação de DNA por real time PCR ou DNA standard 2- Alargar o estudo a áreas encefálicas para aprofundar a selectividade da expressão beta-galactosidase 3- Esclarecer os mecanismos que impedem a detecção da beta-galactosidase

29 Bibliografia Mata M, Glorioso J, Fink DJ. Development of HSV-mediated gene transfer for the treatment of cronic pain. Experimental Neurology Jun; 184(2003)S25-S29Mata M, Glorioso J, Fink DJ. Development of HSV-mediated gene transfer for the treatment of cronic pain. Experimental Neurology Jun; 184(2003)S25-S29 Pohl M, Meunier A, Hamon M, Braz J. Gene Therapy of Cronic Pain. Current Gene Therapy Mar; 3(3):223-38Pohl M, Meunier A, Hamon M, Braz J. Gene Therapy of Cronic Pain. Current Gene Therapy Mar; 3(3): Wilson SP, Yeomans DC, Bender MA, Lu Y, Goins WF, Glorioso JC.Antihyperalgesic effects of infection with a preproenkephalin- enconding herpes virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Mar; 96(1999)Wilson SP, Yeomans DC, Bender MA, Lu Y, Goins WF, Glorioso JC.Antihyperalgesic effects of infection with a preproenkephalin- enconding herpes virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Mar; 96(1999) Wilson SP,Yeomans DC. Genetic Therapy for Pain Management. Current Review of Pain. 2000; 4: Wilson SP,Yeomans DC. Genetic Therapy for Pain Management. Current Review of Pain. 2000; 4: Lopes JMC. Fisiopatologia da Dor. Biblioteca da Dor. Permanyer PortugalLopes JMC. Fisiopatologia da Dor. Biblioteca da Dor. Permanyer Portugal netherapy.shtmlhttp://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/ge netherapy.shtml workshop.com/pain/pain1/content/html/pt/pain1_1.htmlhttp://www.pain- workshop.com/pain/pain1/content/html/pt/pain1_1.htmlhttp://www.pain- workshop.com/pain/pain1/content/html/pt/pain1_1.htmlhttp://www.pain- workshop.com/pain/pain1/content/html/pt/pain1_1.html

30 Agradecimentos Dr.ª Isabel Martins e Prof. Isaura Tavares pela orientação facultada ao longo da realização do nosso trabalho; Laboratório de Biologia Celular e Molecular e Instituto de Histologia e Embriologia Abel Salazar pelo espaço e material disponibilizado; Dr.ª Sandra Rebelo pela amizade; E, ainda, a todos os nossos amigos!

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