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Cultura de células de DRGs e transdução viral Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Instituto de Embriologia e Histologia – Disciplina de Biologia.

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1 Cultura de células de DRGs e transdução viral Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Instituto de Embriologia e Histologia – Disciplina de Biologia Molecular e Celular Porto - 2004 Realizado por: Francisco A. F. Ferro de Beça Francisco M. Pinto da Costa Luís F. Silva Machado Rita M. Marinho Pires Orientado por: Dr a. Joana Gomes

2 Objectivos 1.Estabelecer uma cultura de células;

3 O que é? É um tipo de cultura de tecidos que implica a desagregação (mecânica ou enzimática) do tecido original e em que as células são cultivadas numa camada aderente, num substrato sólido ou em suspensão em meio de cultura. Tipos de cultura de tecidos (adaptado de Freshney, 2000). Cultura de células

4 Limitações Necessidade de operadores experientes (com conhecimentos da técnica asséptica, etc); Custo do esforço e material (baixa quantidade de células produzidas para o material e esforço gasto); Perda de características fenotípicas; Necessidade do uso de marcadores devido à perda de características fenotípicas; Instabilidade das células (sobretudo em linhas celulares imortais). Cultura de células Vantagens Controlo das condições ambientais (pH, temperatura, concentração de O2 e CO2, etc); Obtenção de células com boa homogeneidade e bem caracterizadas; Economia de animais, reagentes, tempo, etc.

5 Algum do material utilizado: Cultura de células

6 Gânglios que se localizam nas raízes dorsais dos nervos raquidianos. Possuem sobretudo os corpos celulares de neurónios aferentes primários sensitivos. –Neurónios pseudounipolares com 2 axonónios: sendo um dirigido à periferia para fazer a enervação sensitiva dos tecidos; e o outro para a medula espinal. Dorsal Root Ganglions (DRGs) Estrutura da medula espinal (adaptado de Martin, 1989). Neurónio de um DRG (adaptado de Kandel et al., 1985).

7 Actividade experimental 1ª experiência (parte 1) - Protocolo 1.Sacrificou-se um ratinho (C57 BL / 6J) e dissecaram-se os DRGs; 2.Procedeu-se à digestão enzimática dos DRGs com colagenase durante 3 horas; 3.Cobriram-se os poços de cultura com PORN (Poly-DL-ornitina hidrobromido) e esterilizaram-se os mesmos com luz UV; 4.Após a digestão enzimática, lavaram-se as células com meio de cultura; 5.Transferiram-se as células para para um falcon com BSA (sterile bovine serum albumin type IV) a 15% e centrifugaram-se (durante 10 min a 1000 rpm); 6.Semearam-se as células nos poços de cultura; 7.Incubaram-se durante 2 dias a 37ºC e a 5% de CO 2.

8 1ª experiência (parte 1) - Resultados

9 Objectivos 1.Estabelecer uma cultura de células; 2.Infectar as células com HSV-1;

10 Neurónio de um DRG (adaptado de Kandel et al., 1985). HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)

11 Genoma extenso (150 Kb) e zona de inserção também (35 Kb); Não integra o seu genoma no da célula hospedeira; Infecta preferencialmente células quiescentes. HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1) Infecção pelo HSV-1 (Adaptado de Fink et al., 1996). Estrutura da partícula viral (Adaptado de Burton et al.,2002). Que vantagens oferece o HSV-1 como vector sobre outros vírus?

12 Utilizou-se uma versão do herpes vírus alterado geneticamente para: Não ser replicativo; Não ser patogénico; Incluir no seu DNA uma cassete contendo a unidade transcripcional do gene codificador da GFP (Green Fluorescence Protein). Esquema do genoma recombinado (adaptado de Wilson et al., 1999). Transcrição em cascata do genoma do HSV wildtype 1. HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)

13 6.Incubaram-se as células com um meio de cultura com HSV-1 (diluição 1/5000 – 8x10 2 Pfu) e durante 2h para infecção das mesmas pelo vírus; 7.Após infecção substituiu-se o meio de cultura com o vírus por novo meio e incubaram-se de novo as células; 8.Passadas 24 horas procedeu-se à fixação das células com etanol e posterior observação destas no microscópio confocal para pesquisa do sinal verde da GFP. 1ª experiência (parte 2) - Protocolo

14 1.Sacrificou-se um rato (Wistar) e dissecaram-se os DRGs. 2.... 6.Adicionou-se NGF (Nerve Growth Factor) ao meio (50 ng/mL). 7.Semearam-se as células nos poços de cultura. 8.Incubaram-se durante 5 dias a 37ºC e a 5% de CO 2. 9.Incubaram-se as células com um meio de cultura com HSV-1 (com 2 diluições diferentes, uma 1/5000 – 8x10 2 Pfu e outra 1/2500 – 1,6x10 3 Pfu) durante 24h para infecção das mesmas pelo vírus. 10.Substituiu-se o meio de cultura com o vírus por novo meio de cultura e incubaram-se de novo as células durante 2 dias. 11.Procedeu-se à fixação das células em PFA (Paraformaldeído) (a 4%) e posterior observação destas ao microscópio confocal para pesquisa do sinal verde da GFP. 2ª experiência (parte 1) - Protocolo

15 2ª experiência (parte 1) - Resultados

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17 Objectivos 1.Estabelecer uma cultura de células. 2.Infectar as células com HSV-1. 3.Verificar se as células infectadas eram de facto neurónios.

18 13.Seguidamente, realizou-se uma imunocitoquímica começando por se lavar duas vezes os poços com PBS (Phosphate Bufer Salive) ( 8 min cada lavagem); 14.Lavaram-se os poços com PBS-T (PBS+Triton)(durante 5min); 15.Adicionou-se uma solução de PBS+glicínia+NGS (Normal Goat Serum)(15mg glicínia em 2mL de PBS e 10% de NGS) e aguardou-se 1 hora; 16.Retirou-se a solução anterior e adicionou-se o anticorpo primário anti-Neu N, utilizando-se duas soluções (anti-Neu N em PBS + 2% NGS) com concentrações diferentes ( 1/2500 e 1/5000); 17.Incubou-se à temperatura ambiente overnight; 18.Lavaram-se os poços duas vezes com PBS e uma com PBS-T como anteriormente; 19.Adicionou-se o anticorpo secundário goat anti-mouse (goat anti-mouse em PBS com uma diluição 1/1000) e aguardou-se 1 hora; 20.Lavaram-se os poços com PBS 2 vezes (5 min cada lavagem); 21.Observou-se ao microscópio confocal para pesquisa do sinal. 2ª experiência (parte 2) - Protocolo

19 O protocolo usado foi o basicamente o mesmo da 2ª experiência com as seguintes alterações: 1.Voltamos a utilizar ratinhos em vez de ratos; 2.Apenas incubamos as células 3 dias antes de as infectarmos com o HSV-1; 3.Na imunocitoquímica não realizamos as lavagens com PBS-T. 3ª experiência - Protocolo

20 3ª experiência - Resultados

21 3ª experiência – Resultados

22 Conclusões Foi possível estabelecer uma cultura de DRGs viáveis ultrapassando a complexidade da técnica da cultura celular; Ocorreu uma transdução viral eficiente e consequente expressão da GFP nas células em cultura; Verificou-se que o vírus infectou neurónios bem como outras células. Efectuar uma contagem dos sinais para se conhecer a percentagem de células infectadas pelo HSV-1 face à percentagem de neurónios. Realizar novas imunocitoquimicas com outros marcadores (p.e. GFAP para certas células gliais) de forma a conhecer os outros tipos de células infectados pelo HSV-1, bem como a percentagem de infecção. Elaborar um novo protocolo que permita investigar se a entrada do vírus nos neurónios se processa pelos prolongamentos celulares ou se efectivamente entra pelo corpo celular. Estratégias a seguir em trabalhos futuros

23 Bibliografia Burton E. A., Fink D. J., Glorioso J. C.. Gene delivery using herpes simplex virus vectors. (2002) DNA and Cell Biology, 21(12):915-36. Fink D. J., DeLuca N. A., Goins W. F., Glorioso J. C.. Gene transfert to neurons using herpes simplex virus-based vectors. (1996). Anual Review of Neuroscience, 19:265-87. Freshney R.I.. Culture of Animal Cells, a manual of basic technique. 4th ed., (2000), Wiley-Liss. chapter 1, p. 7, fig. 1.2. Kelly J.P.. Anatomical Basis of Sensory Perception and Motor Coordination in: Kandel, E.R. and Schwartz J.H. (edit). Principles of Neuronal Science. 2nd ed.,(1985), Elsevier. Vol 20, p. 223, fig.20- 1. Martin J.H. Neuroanatomy, Text and Atlas. 1st ed., (1989), Elsevier. p.8, fig. 1.4. Mullen, R. J. Buck, C.R. Smith, A. M.. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. (1992), Developement, p.201-211. Wilson S. P., Yeomans D. C., Bender M.A., Lu Y, Goins W.F., Glorioso J.C.. Antihyperalgesic effects of infection with a preproenkephaline-encoding herpes simplex. (1999) Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96:3211-3216.

24 Agradecimentos À Dr a. Isabel Martins por nos ter disponibilizado as amostras de HSV-1, informação sobre o mesmo e ainda pela ajuda na operação do microscópio confocal bem como na realização desta apresentação. À Prof a. Fani Neto e à Dr a. Sandra Rebelo pela disponibilização do material biológico (ratinhos e ratos).


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