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Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

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1 Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

2 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR PCR Real Time PCR Real Time PCR NASBA/TMA NASBA/TMA

3 PCR

4

5 OPTIMIZAÇÃO DO PCR [MgCl 2 ] [MgCl 2 ] Th Th [dNTP] [dNTP] [primers] [primers] [DNA] [DNA] [inibidores] [inibidores]

6 Variantes do PCR RT-PCR RNAcDNA RT prod. ampl. PCR Nested PCR 1º PCR 2º PCR

7 Nested - PCR

8 PCR Multiplex

9 Variantes do PCR RT-PCR RT-PCR Multiplex PCR Multiplex PCR Nested PCR Nested PCR Assymetric PCR Assymetric PCR Degenerate PCR Degenerate PCR Hot Start PCR Hot Start PCR In Situ PCR In Situ PCR Long-PCR Long-PCR PCR-ELISA PCR-RFLP PCR-SSCP RAPD-PCR REP-PCR Touchdown PCR

10 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR PCR Real Time PCR Real Time PCR NASBA/TMA NASBA/TMA

11 Prof.Doutor José Cabeda Principio de funcionamento do Real-Time PCR

12 Detecção dos produtos de PCR

13 Montar uma reacção

14 Prof.Doutor José Cabeda Químicas Utilizáveis

15 SYBR-Green I SG Excitation SG

16 SYBR-Green I SG Excitation Emission

17 Detcção com SybGreen

18 Sybr-Green Detection Intercalates to dsDNA Intercalates to dsDNA Inhibits DNA amplification so concentration is critical Inhibits DNA amplification so concentration is critical Detects specific and non- specific targets Detects specific and non- specific targets Low starting background with large increase in signal Low starting background with large increase in signal Can run a melt curve to look at product specificity Can run a melt curve to look at product specificity

19 Detecção com sondas

20 Quimicas utilizáveis: sondas taqman

21 R Q Sequence specific probes: Dual labeled probes Excitation R Q Q R Q R

22 Quimicas utilizáveis: molecular beacons

23 Molecular Beacons I 10mer 25mer FAM DabCyl

24 Molecular Beacons II R Q Excitation R Q Q R Emission

25 Can be used to quantitation and mutation detection Can be used to quantitation and mutation detection Need beacons for the normal and mutation sequence Need beacons for the normal and mutation sequence Design is difficult due to nature of folding structure Design is difficult due to nature of folding structure Expensive when compared to FRET Expensive when compared to FRET Molecular Beacons III

26 Quimicas utilizáveis: sondas FRET

27 Prof.Doutor José Cabeda Hyb-Probes TM Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Excitation Emission Transfer

28 Quenched FRET analysis Two labeled probes, FAM at the 5 and BH1 on the 3 Two labeled probes, FAM at the 5 and BH1 on the 3 When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 After the product is amplified run a melt curve to determine genotype After the product is amplified run a melt curve to determine genotype Different melt points are seen for normal and mutation Different melt points are seen for normal and mutation 53

29 Quimicas utilizáveis: sondas Eclipse

30 Prof.Doutor José Cabeda Aplicações Quantificação

31 End Point versus Real-Time

32 Quantificação

33 Prof.Doutor José Cabeda Aplicações Detecção de Mutações / SNP

34 Detecção de mutações

35 Prof.Doutor José Cabeda Aplicações Multiplex Detection

36 Detecção simultânea de vários produtos

37 Prof.Doutor José Cabeda Os equipamentos

38

39 LightCycler

40 SmartCycler

41 Rotorgene The samples spin continually during a run at 500 rpm The samples are heated and cooled in a low mass air oven Tubes are illuminated as they pass the detector On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample Four Channels Ch1: ex 470nm, det 510nm Ch2: ex 530nm, det 550nm Ch3: ex 585nm, det 610nm Ch4: ex 625nm, det 660nm

42 Near Patient Testing Laboratório de Urgência

43 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR PCR Real Time PCR Real Time PCR NASBA/TMA NASBA/TMA

44 NASBA/ NUCLISENS

45 Amplification: schematic diagram Primer 1 Reverse Transcriptase RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase RNase H Primer 1 sense RNA antisense RNA sense DNA antisense DNA Legend:

46 Técnicas de amplificação de Sinal bDNA (Quantiplex) bDNA (Quantiplex)

47 bDNA (I)

48 bDNA (II)

49 bDNA (III)

50 bDNA (IV)

51 bDNA (V)

52 SDA DNA Plymerase Restriction enzyme

53 Prof.Doutor José Cabeda Aplicações de técnicas de amplificação de AN ao diagnóstico microbiológico

54 MÉTODOS CONVENCIONAIS NO DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Caracterização microscópica Crescimento in vitro em meios sintéticos Caracterização bioquímica Demonstração imunológica da presença dos/ contacto com microorganismos

55 LIMITAÇÕES DOS MÉTODOS CONVENCIONAIS MÉTODOLIMITAÇÃOEXEMPLOS Cultural Meios e condições de cultura especiais Mycoplasma spp., Legionella spp Culturas celulares Vírus, bactérias intracelulares obrigatórias Incapacidade de crescer in vitro M. leprae, T. pallidum, HPV, HCV.... Microrganismos de crescimento lento Mycobacterium spp., fungos

56 LIMITAÇÕES DOS MÉTODOS CONVENCIONAIS MÉTODOLIMITAÇÃO Serológico Sem utilidade na fase aguda diagnóstico retrospectivo Problemático no hospedeiro imunocomprometido Reactividade cruzada Interpretação complexa

57 DIAGNÓSTICO MOLECULAR Sensibilidade Especificidade Rapidez Diagnóstico etiológico em tempo clinicamente útil Evitar terapias empíricas Administração precoce de terapia específica Diminuição do tempo e custos da hospitalização PCR Tempo Real

58 ÁREAS DE APLICAÇÃO Detecção de Resistência aos Antimicrobianos Detecção de Resistência aos Antimicrobianos Diagnóstico das Doenças Infecciosas UBM - HGSA

59 O que fazemos (Microbiologia) Microbiologia Microbiologia Detecção/quantificação de agentes patogénicos Detecção/quantificação de agentes patogénicos Vírus Vírus Bactérias Bactérias Genotipagem viral Genotipagem viral Detecção de resistências a drogas Detecção de resistências a drogas Detecção de genótipos associados a resistência Detecção de genótipos associados a resistência Epidemiologia Epidemiologia Infecção nosocomial Infecção nosocomial

60 Áreas de Intervenção (II) Urgentes Virologia Virologia Detecção de agentes Detecção de agentes Identificação de agentes Identificação de agentes Resistências a drogas Resistências a drogas Microbiologia Microbiologia Detecção de agentes Detecção de agentes Identificação de agentes Identificação de agentes Resistências a drogas Resistências a drogas Hematologia Hematologia Doenças oncológicas Doenças oncológicas Estudo de genes quimera Estudo de genes quimera Estudo de Doença Res.Mín. Estudo de Doença Res.Mín. Estudo de monoclonalidade Estudo de monoclonalidade Estudo de Quimerismo Estudo de Quimerismo Não Urgentes Hematologia/Imunologia Doenças Genéticas Monogénicas Estudo de Mutações Estudo de haplótipos Multifactoriais Estudo de polimorfismos (factores genéticos de risco) Anatomia Patológica Biópsias Detecção de patogénios Detecção de monoclonalidade ThinPrep Detecção de HPV

61 Virologia Sistema Nervoso Central HSV1/2 HSV1/2 EBV EBV CMV CMV VZV VZV HHV-6 HHV-6 Enterovirus Enterovirus Transmissíveis p/ sangue HIV HBV HCV Outros HTLV-1 HPV Poliomavirus (JCV e BKV)

62 Microbiologia Detecção de bacterias Micobacterium tuberculosis Micobacterium tuberculosis Leptospira spp Leptospira spp Pneumonias atípicas Pneumonias atípicas Legionella spp. Legionella spp. Legionella pneumophila Legionella pneumophila Legionella genus Legionella genus Micoplasma pneumoniae Micoplasma pneumoniae Chlamydia pneumoniae Chlamydia pneumoniae Staphylococcus spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Enterococcus spp. Helicobacter pylori Helicobacter pylori Clostridium difficile (tcdA,tcdB) Clostridium difficile (tcdA,tcdB) Bordetella pertussis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Borrelia burgdorferi 16S rDNA 16S rDNA Identificação de bactérias Micobacterium tuberculosis complex Micobacterium avium Micobacterium avium complex Micobacterium kanzasii Micobacterium intracelulare Micobacterium Gordonae Resistencias a drogas Meticilina Glicopeptídeos Rifampicina Isoniazida Antiretrovirais

63 Escolha da tecnologia (I) Real-Time-PCR Mais rápido (até 1 hora) Mais rápido (até 1 hora) Mais sensível Mais sensível Menor risco de contaminação Menor risco de contaminação Uma só tecnologia faz Uma só tecnologia faz Amplificação Amplificação Detecção Detecção Caracterização Caracterização PCR convencional Mais barato Muitos protocolos disponíveis Mais fácil de montar para: Multiplex Nested

64 Chromo 4 (MJ Research) Rotorgene (pyrosequencing) MyiQ (BioRad) R.A.P.I.D (Yahoo) LightCyclerSmartCycler (cepheid) 7000 / 7300 / 7500 / 7900HT (Applied Biosystems) SmartCycler-TD (cepheid) Opticon (MJ Research) MX3000P (Stratagene) MX4000 (Stratagene) Escolha da tecnologia (II)

65 Escolha da tecnologia (III)LightCycler O mais rápido (cerca de 20) O mais rápido (cerca de 20) Muitos protocolos disponíveis Muitos protocolos disponíveis 32 amostras/corrida 32 amostras/corrida Fluorocromos limitados na versão original Fluorocromos limitados na versão original SmartCycler Bastante rápido (cerca de 30) Disponível em 25 l e 100 l: PCR preparatívos Aumento do input amostra Conversão de PCR convencional facilitada 16 estações independentes 16 programas simultânos Apenas 16 amostras

66 Infecções víricas do SNC HERPESVIRUS Sensitivity Sensitivity HSV copies/mL HSV copies/mL HSV copies/mL HSV copies/mL VZV 500 copies/mL VZV 500 copies/mL CMV 315 copies/mL CMV 315 copies/mL HHV-6 1/50 HHV-6 1/50 EBV 1/10 EBV 1/10 Response time: 4 hours + Response time: 4 hours + ENTEROVIRUS Sensitivity* CoxA TCID 50 CoxA TCID 50 CoxB5 320 TCID 50 Echo11 25 TCID 50 Echo TCID 50 ENT71 56 TCID 50 Response time: 4 hours

67 SingleNested Cox A9 Cox A16 Cox B5 ENT71 RHINO Neg. 3,9 0, ,2 0 TCID50/ml Single Nested Lab1 + +/ Lab Lab3 A vantagem do Nested (Enterovírus)

68 Single RT-PCRNested RT-PCR Amostras clínicas (162 LCR)

69 Detecção de bactérias Bacteriologia Leptospiras B.burgdorferi H.pylori M.pneumoniae C.pneumoniae L.pneumophila M.tuberculosis Bordetella Pertussis Clostridium difficile B.burgdorferi M.tuberculosis M.pneumoniae Leptospiras H.pylori

70 Biópsias Gástricas Frescas Biópsias Gástricas Fixadas Extracção de DNA: Homogeneização dos Tecidos Lise Celular Desnaturação Proteica Tampão de Lise de Tecidos Fast Prep Temperatura de 95 ºC Proteinase K Magna Pure LC DNA Isolation Kit - Tissue Helicobacter pylori 60 m

71 Detecção de H. pylori – Multiplex PCR em Tempo Real Smart Cycler Urease -Globina (Controlo Interno) Ensaio in house 2 Pares de Primers (Urease / -Globina) Sondas TaqMan Helicobacter pylori

72 Detecção de Resistência à Claritromicina – PCR em Tempo Real Light Cycler Amplificação do Gene 23S rRNA Sondas FRET Análise de Melting Tempo de Resposta: ~ 5 H Estirpe Tmelting (ºC) Wild - type 61.5 Mut (A2142C) 58.0 Mut (A2142G) 53.0 Mut (A2143G) 53.6 Helicobacter pylori

73 PNEUMONIAS ATÍPICAS M. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila TÉCNICA: PCR em Tempo Real – SMART CYCLER TÉCNICA: PCR em Tempo Real – SMART CYCLER 3 ENSAIOS DE PCR Efectuados individualmente para a detecção de cada um dos microrganismos

74 PNEUMONIAS ATÍPICAS M. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila TEMPO DE RESPOSTA: 3 H VS 48 H PCR Convencional TEMPO DE RESPOSTA: 3 H VS 48 H PCR Convencional ESPECIFICIDADE ESPECIFICIDADE SENSIBILIDADE SENSIBILIDADE LIMITE DE DETECÇÃO: LIMITE DE DETECÇÃO: L. pneumophila - 18 UFC/ml AMOSTRAS: AMOSTRAS:LBALCRExpectorações... M. pneumoniae C. pneumoniae L. pneumophila

75 LEPTOSPIROSE (UBM-HGSA) Amplificação do 23SrDNA (género Leptospira) e detecção específica de 6 espécies patogénicas Amplificação do 23SrDNA (género Leptospira) e detecção específica de 6 espécies patogénicas Amostras de urina, sangue, LCR Amostras de urina, sangue, LCR PCR em Tempo Real (Light Cycler) PCR em Tempo Real (Light Cycler) Limite de detecção: cultura = ; Urina inoculada = Limite de detecção: cultura = ; Urina inoculada = 10 -7

76 LEPTOSPIRA TÉCNICA : PCR em Tempo Real – LIGHT CYCLER TÉCNICA : PCR em Tempo Real – LIGHT CYCLER Amplificação do gene 23S rDNA que permite num só ensaio a detecção de 6 espécies patogénicas TEMPO DE RESPOSTA: 3 H (Considerando o tempo dispendido no pré- -tratamento das amostras de urina) TEMPO DE RESPOSTA: 3 H (Considerando o tempo dispendido no pré- -tratamento das amostras de urina) AMOSTRAS: AMOSTRAS:UrinaSangueLCRBiópsias...

77 Bordetella pertussis Detecção molecular de IS 481 Detecção molecular de IS 481 Amostras: Amostras: Secreções nasofarínge Secreções nasofarínge Zaragatoa nasofarínge Zaragatoa nasofarínge Armazenar a 4ºC Armazenar a 4ºC Volume mínimo amostra 400 l Volume mínimo amostra 400 l Extracção de ácidos nucleicos Extracção de ácidos nucleicos EZ 1 BioRobot – Qiagen EZ 1 BioRobot – Qiagen

78 Bordetella pertussis Limite de detecção Limite de detecção ATCC 9797D ATCC 9797D DNA genómico B. pertussis Diluições seriadas a Diluições seriadas a x10 -7 ng/mL 1,5 genomas/PCR 14x10 -7 ng/mL 1,5 genomas/PCR Bordetella pertussis ATCC 9797D DiluiçãoConcentraçãoResultado ng/ L POS ,4ng/ L POS ,4x10 -1 ng/ L POS ,4x10 -2 ng/ L POS ,4x10 -3 ng/ L POS ,4x10 -4 ng/ L POS ,4x10 -5 ng/ L POS ,4x10 -6 ng/ L POS ,4x10 -7 ng/ L +/ ,4x10 -8 ng/ L NEG

79 Detecção de C. difficile de fezes - Multiplex PCR em Tempo Real Smart Cycler Gene tcdA: Toxina A Gene tcdB: Toxina B 2 Pares de Primers Sondas FAM: Toxina A TET: Toxina B Tempo de Resposta: ~ 3 H Controlo de Inibição Sensibilidade Analítica: 10 cópias genoma por reacção de PCR Clostridium difficile

80 DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS (UBM-HGSA) BACTÉRIARESISTÊNCIAMUTAÇÕES Mycobacterium tuberculosis Rifampicina rpoB 526(CAC GAC) 531 (TCG TTG) 531 (TCG TTG) 533 (CTG CCG) 533 (CTG CCG) Isoniazida katG 315 (AGC ACC) 315 (AGC AAC) 315 (AGC AAC) Helicobacter pylori Claritromicina 23S rDNA

81 TUBERCULOSE Identificação de isolados de cultura Identificação directa de produtos biológicos (em desenvolvimento) EspécieTm M. tuberculosis63ºC M. kansasii59ºC M.avium58ºC M.intracellulare54ºC M.gordonae49ºC

82 16S rDNA Gene 16S rDNA – natureza conservada no reino procariota Gene 16S rDNA – natureza conservada no reino procariota PCR Universal uma reacção amplifica vários agentes PCR Universal uma reacção amplifica vários agentes Detecção da presença de bactérias em amostras clínicas estéreis Detecção da presença de bactérias em amostras clínicas estéreis

83 16S rDNA Aplicações: Aplicações: LCR, Sangue, produtos biológicos estéreis LCR, Sangue, produtos biológicos estéreis Problemas: Problemas: Detecção de bactérias inviáveis Detecção de bactérias inviáveis Risco de contaminação laboratorial Risco de contaminação laboratorial Risco de contaminação na colheita Risco de contaminação na colheita Correlacionar resultados positivos com a clínica

84 Inactivação do DNA exógeno (irradiação UV reagentes/material) Inactivação do DNA exógeno (irradiação UV reagentes/material) Extracção de ácidos nucleicos Extracção de ácidos nucleicos Bactérias Gram - Bactérias Gram - Bactérias Gram + Bactérias Gram + Micobactérias Micobactérias Lise enzimática / mecânica Lise enzimática / mecânica Magna Pure LC, Roche Magna Pure LC, Roche Total Nucleic Acid Isolation Kit Total Nucleic Acid Isolation Kit Amplificação Amplificação Smart Cycler, Cepheid - PCR em Tempo Real Smart Cycler, Cepheid - PCR em Tempo Real Múltiplos controlos negativos (extracção, amplificação) Múltiplos controlos negativos (extracção, amplificação) 16S rDNA

85 Sensibilidade analítica do método Sensibilidade analítica do método S. aureus 160 UFC/mL S. aureus 160 UFC/mL E. coli 200 UFC/mL E. coli 200 UFC/mL Aplicação a 76 amostras de LCR (Meningite Bacteriana Aguda) Aplicação a 76 amostras de LCR (Meningite Bacteriana Aguda) Sensibilidade: 80%; Especificidade: 94.5% Sensibilidade: 80%; Especificidade: 94.5% VPP: 84%; VPN: 92.7% VPP: 84%; VPN: 92.7% Resultado – POSITIVO/NEGATIVO Resultado – POSITIVO/NEGATIVO

86 EspécieOrigem PCR em tempo real E. coli ATCC Pos S. aureus ATCC Pos E. faecalis ATCC Pos S. pneumoniae ATCC 6305 Pos P. mirabilis ATCC Pos E. cloacae ATCC Pos K. pneumoniae ATCC Pos P. aeruginosa ATCC Pos H. influenzae ATCC Pos N. meningitidis Isolado clínico Pos L. monocytogenes Isolado clínico Pos S. epidermidis Isolado clínico Pos S.agalactiae Pos M. tuberculosis Isolado clínico Pos Leptospira sp Isolado clínico Pos 16S rDNA

87 Estirpes detectadas por outros autores com os mesmos primers Acinetobacter calcoaceticus Clostridium perfringens Aeromonas hydrophila Corynebacterium genitalium Alcaligenes faecalis Erysipelothrix rhusiophathiae Bacteroides fragilis Gardnerella vaginalis Campylobacter fetus Lactobacillus acidophilus Campylobacter jejuni Leuconostoc paramesenteroides Eikenella corrodens Micrococcus luteus Mycoplasma genitalium Flavobacterium meningosepticum Legionella pneumophila Mycoplasma hominis Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Peptostreptococcus anaerobius Providencia stuartii Peptostreptococcus magnus Salmonella typhimurium Propionibacterium acnes Serratia marcescens Streptococcus mitis Yersinia enterocolitica Streptococcus sanguis

88 Desafio: Desafio: sensibilidade sem comprometer a especificidade sensibilidade sem comprometer a especificidade Kits de Extracção M Grade Kits de Extracção M Grade Enzimas LowDNA Enzimas LowDNA Essencial: Essencial: Resultados positivos Identificação do produto amplificado Distinguir contaminações de verdadeiros positivos Distinguir contaminações de verdadeiros positivos Correlação com clínica Correlação com clínica Valor Preditivo Positivo Valor Preditivo Positivo Sensibilidade Sensibilidade 16S rDNA


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