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Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica

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Apresentação em tema: "Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica"— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica
TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Prof.Doutor José Cabeda

2 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCR Real Time PCR NASBA/TMA

3 PCR

4

5 OPTIMIZAÇÃO DO PCR [MgCl2] Th [dNTP] [primers] [DNA] [inibidores]

6 Variantes do PCR RT-PCR Nested PCR RNA cDNA RT prod. ampl. PCR 1º PCR

7 Nested - PCR

8 PCR Multiplex

9 Variantes do PCR RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR Assymetric PCR
Degenerate PCR Hot Start PCR In Situ PCR Long-PCR PCR-ELISA PCR-RFLP PCR-SSCP RAPD-PCR REP-PCR Touchdown PCR

10 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCR Real Time PCR NASBA/TMA

11 Principio de funcionamento do Real-Time PCR
Prof.Doutor José Cabeda

12 Detecção dos produtos de PCR

13 Montar uma reacção

14 Prof.Doutor José Cabeda
Químicas Utilizáveis Prof.Doutor José Cabeda

15 SYBR-Green I Excitation 5’ 3’ SG SG SG SG SG

16 SYBR-Green I Excitation Emission SG SG 5’ 3’ SG SG SG

17 Detcção com SybGreen

18 Sybr-Green Detection Intercalates to dsDNA
Inhibits DNA amplification so concentration is critical Detects specific and non-specific targets Low starting background with large increase in signal Can run a melt curve to look at product specificity

19 Detecção com sondas

20 Quimicas utilizáveis: sondas taqman

21 Sequence specific probes: Dual labeled probes
5’ 3’ Excitation Excitation 5’ 3’ Q R R R Q Q R Q

22 Quimicas utilizáveis: molecular beacons

23 Molecular Beacons I 10mer 25mer FAM DabCyl

24 Molecular Beacons II Emission R Q Excitation R Q Q R X

25 Molecular Beacons III Can be used to quantitation and mutation detection Need beacons for the normal and mutation sequence Design is difficult due to nature of folding structure Expensive when compared to FRET

26 Quimicas utilizáveis: sondas FRET

27 Prof.Doutor José Cabeda
Hyb-ProbesTM Emission Excitation Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Transfer Prof.Doutor José Cabeda

28 Quenched FRET analysis
5’ 3’ Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’ When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 After the product is amplified run a melt curve to determine genotype Different melt points are seen for normal and mutation

29 Quimicas utilizáveis: sondas Eclipse
F Q MGB Q F

30 Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações Quantificação Prof.Doutor José Cabeda

31 End Point versus Real-Time

32 Quantificação

33 Detecção de Mutações / SNP
Aplicações Detecção de Mutações / SNP Prof.Doutor José Cabeda

34 Detecção de mutações

35 Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações Multiplex Detection Prof.Doutor José Cabeda

36 Detecção simultânea de vários produtos

37 Prof.Doutor José Cabeda
Os equipamentos Prof.Doutor José Cabeda

38

39 LightCycler

40 SmartCycler

41 Rotorgene The samples spin continually during a run at 500 rpm
The samples are heated and cooled in a low mass air oven Tubes are illuminated as they pass the detector On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample Four Channels Ch1: ex 470nm, det 510nm Ch2: ex 530nm, det 550nm Ch3: ex 585nm, det 610nm Ch4: ex 625nm, det 660nm

42 Near Patient Testing Laboratório de Urgência

43 Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos
PCR Real Time PCR NASBA/TMA

44 NASBA/ NUCLISENS

45 Amplification: schematic diagram
Primer 1 Legend: sense RNA antisense RNA sense DNA antisense DNA Reverse Transcriptase RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase RNase H Primer 1

46 Técnicas de amplificação de Sinal
bDNA (Quantiplex)

47 bDNA (I)

48 bDNA (II)

49 bDNA (III)

50 bDNA (IV)

51 bDNA (V)

52 SDA DNA Plymerase Restriction enzyme

53 Prof.Doutor José Cabeda
Aplicações de técnicas de amplificação de AN ao diagnóstico microbiológico Prof.Doutor José Cabeda

54 MÉTODOS CONVENCIONAIS NO DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Caracterização microscópica Crescimento “in vitro” em meios sintéticos Caracterização bioquímica Demonstração imunológica da presença dos/ contacto com microorganismos

55 LIMITAÇÕES DOS MÉTODOS CONVENCIONAIS
LIMITAÇÃO EXEMPLOS Cultural Meios e condições de cultura especiais Mycoplasma spp., Legionella spp...... Culturas celulares Vírus, bactérias intracelulares obrigatórias Incapacidade de crescer “in vitro” M. leprae, T. pallidum, HPV, HCV.... Microrganismos de crescimento lento Mycobacterium spp., fungos

56 LIMITAÇÕES DOS MÉTODOS CONVENCIONAIS
LIMITAÇÃO Serológico Sem utilidade na fase aguda  diagnóstico retrospectivo Problemático no hospedeiro imunocomprometido Reactividade cruzada Interpretação complexa

57 DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Diagnóstico etiológico em tempo clinicamente útil Evitar terapias empíricas Administração precoce de terapia específica Diminuição do tempo e custos da hospitalização Sensibilidade Especificidade Rapidez PCR Tempo Real

58 ÁREAS DE APLICAÇÃO Diagnóstico das Doenças Infecciosas
Detecção de Resistência aos Antimicrobianos UBM - HGSA

59 O que fazemos (Microbiologia)
Detecção/quantificação de agentes patogénicos Vírus Bactérias Genotipagem viral Detecção de resistências a drogas Detecção de genótipos associados a resistência Epidemiologia Infecção nosocomial

60 Áreas de Intervenção (II)
Urgentes Virologia Detecção de agentes Identificação de agentes Resistências a drogas Microbiologia Hematologia Doenças oncológicas Estudo de genes quimera Estudo de Doença Res.Mín. Estudo de monoclonalidade Estudo de Quimerismo Não Urgentes Hematologia/Imunologia Doenças Genéticas Monogénicas Estudo de Mutações Estudo de haplótipos Multifactoriais Estudo de polimorfismos (factores genéticos de risco) Anatomia Patológica Biópsias Detecção de patogénios Detecção de monoclonalidade ThinPrep Detecção de HPV

61 Sistema Nervoso Central Transmissíveis p/ sangue
Virologia Sistema Nervoso Central HSV1/2 EBV CMV VZV HHV-6 Enterovirus Transmissíveis p/ sangue HIV HBV HCV Outros HTLV-1 HPV Poliomavirus (JCV e BKV)

62 Identificação de bactérias
Microbiologia Detecção de bacterias Micobacterium tuberculosis Leptospira spp Pneumonias atípicas Legionella spp. Legionella pneumophila Legionella genus Micoplasma pneumoniae Chlamydia pneumoniae Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Helicobacter pylori Clostridium difficile (tcdA,tcdB) Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi 16S rDNA Identificação de bactérias Micobacterium tuberculosis complex Micobacterium avium Micobacterium avium complex Micobacterium kanzasii Micobacterium intracelulare Micobacterium Gordonae Resistencias a drogas Meticilina Glicopeptídeos Rifampicina Isoniazida Antiretrovirais

63 Escolha da tecnologia (I)
Real-Time-PCR Mais rápido (até 1 hora) Mais sensível Menor risco de contaminação Uma só tecnologia faz Amplificação Detecção Caracterização PCR convencional Mais barato Muitos protocolos disponíveis Mais fácil de montar para: Multiplex Nested

64 Escolha da tecnologia (II)
R.A.P.I.D (Yahoo) Rotorgene (pyrosequencing) MyiQ (BioRad) LightCycler SmartCycler (cepheid) SmartCycler-TD (cepheid) MX3000P (Stratagene) MX4000 (Stratagene) Opticon (MJ Research) Chromo 4 (MJ Research) 7000 / 7300 / 7500 / 7900HT (Applied Biosystems)

65 Escolha da tecnologia (III)
LightCycler O mais rápido (cerca de 20’) Muitos protocolos disponíveis 32 amostras/corrida Fluorocromos limitados na versão original SmartCycler Bastante rápido (cerca de 30’) Disponível em 25ml e 100ml: PCR preparatívos Aumento do input amostra Conversão de PCR convencional facilitada 16 estações independentes 16 programas simultânos Apenas 16 amostras

66 Infecções víricas do SNC
HERPESVIRUS Sensitivity HSV-1  200 copies/mL HSV-2  100 copies/mL VZV  500 copies/mL CMV  315 copies/mL HHV-6  1/50 EBV  1/10 Response time: 4 hours+ ENTEROVIRUS Sensitivity* CoxA16  0.25 TCID50 CoxA9  TCID50 CoxB5  320 TCID50 Echo11  TCID50 Echo6  2000 TCID50 ENT71  56 TCID50 Response time: 4 hours

67 A vantagem do Nested (Enterovírus)
10-2 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 + - Single Nested Cox A9 Cox A16 Cox B5 ENT71 RHINO Neg. 3,9 0,25 320 32 56 3,2 TCID50/ml - + Single Nested Lab1 +/- Lab2 Lab3

68 A vantagem do Nested (Enterovírus)
Amostras clínicas (162 LCR) Single RT-PCR Nested RT-PCR

69 Detecção de bactérias Bacteriologia Leptospiras B.burgdorferi H.pylori
M.pneumoniae C.pneumoniae L.pneumophila M.tuberculosis Bordetella Pertussis Clostridium difficile B.burgdorferi M.pneumoniae H.pylori M.tuberculosis

70 Helicobacter pylori 60 m Biópsias Gástricas Frescas
Biópsias Gástricas Fixadas Extracção de DNA: Homogeneização dos Tecidos Lise Celular Desnaturação Proteica 60 m Tampão de Lise de Tecidos Fast Prep Temperatura de 95 ºC Proteinase K Magna Pure LC DNA Isolation Kit - Tissue

71 Detecção de H. pylori – Multiplex PCR em Tempo Real
Helicobacter pylori Detecção de H. pylori – Multiplex PCR em Tempo Real Smart Cycler Urease -Globina (Controlo Interno) Ensaio “in house” 2 Pares de Primers (Urease / -Globina) Sondas TaqMan

72 Detecção de Resistência à Claritromicina – PCR em Tempo Real
Helicobacter pylori Detecção de Resistência à Claritromicina – PCR em Tempo Real Light Cycler Amplificação do Gene 23S rRNA Sondas FRET Análise de Melting Tempo de Resposta: ~ 5 H Estirpe Tmelting (ºC) Wild - type 61.5 Mut (A2142C) 58.0 Mut (A2142G) 53.0 Mut (A2143G) 53.6

73 PNEUMONIAS ATÍPICAS M. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila
TÉCNICA: PCR em Tempo Real – SMART CYCLER 3 ENSAIOS DE PCR Efectuados individualmente para a detecção de cada um dos microrganismos

74 PNEUMONIAS ATÍPICAS M. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila
TEMPO DE RESPOSTA: 3 H VS 48 H PCR Convencional  ESPECIFICIDADE  SENSIBILIDADE LIMITE DE DETECÇÃO: L. pneumophila - 18 UFC/ml AMOSTRAS: LBA LCR Expectorações... L. pneumophila C. pneumoniae M. pneumoniae

75 LEPTOSPIROSE (UBM-HGSA)
Amplificação do 23SrDNA (género Leptospira) e detecção específica de 6 espécies patogénicas Amostras de urina, sangue, LCR PCR em Tempo Real (Light Cycler) Limite de detecção: cultura = 10-12; Urina inoculada = 10-7

76 LEPTOSPIRA TÉCNICA : PCR em Tempo Real – LIGHT CYCLER
Amplificação do gene 23S rDNA que permite num só ensaio a detecção de 6 espécies patogénicas TEMPO DE RESPOSTA: 3 H (Considerando o tempo dispendido no pré tratamento das amostras de urina) AMOSTRAS: Urina Sangue LCR Biópsias...

77 Bordetella pertussis Amostras: Secreções nasofarínge
Detecção molecular de IS 481 Amostras: Secreções nasofarínge Zaragatoa nasofarínge Armazenar a 4ºC Volume mínimo amostra  400ml Extracção de ácidos nucleicos EZ 1 BioRobot – Qiagen

78 Bordetella pertussis ATCC 9797D
Limite de detecção ATCC 9797D DNA genómico B. pertussis Diluições seriadas  10-1 a 10-10 14x10-7ng/mL  1,5 genomas/PCR Bordetella pertussis ATCC 9797D Diluição Concentração Resultado 10-1 14ng/mL POS 10-2 1,4ng/mL 10-3 1,4x10-1ng/mL 10-4 1,4x10-2ng/mL 10-5 1,4x10-3ng/mL 10-6 1,4x10-4ng/mL 10-7 1,4x10-5ng/mL 10-8 1,4x10-6ng/mL 10-9 1,4x10-7ng/mL +/- 10-10 1,4x10-8ng/mL NEG

79 Detecção de C. difficile de fezes - Multiplex PCR em Tempo Real
Clostridium difficile Detecção de C. difficile de fezes - Multiplex PCR em Tempo Real Smart Cycler Gene tcdA: Toxina A  Gene tcdB: Toxina B 2 Pares de Primers Sondas FAM: Toxina A TET: Toxina B Tempo de Resposta: ~ 3 H Controlo de Inibição Sensibilidade Analítica: 10 cópias genoma por reacção de PCR

80 DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS (UBM-HGSA)
BACTÉRIA RESISTÊNCIA MUTAÇÕES Mycobacterium tuberculosis Rifampicina rpoB 526(CACGAC) 531 (TCGTTG) 533 (CTGCCG) Isoniazida katG 315 (AGCACC) 315 (AGCAAC) Helicobacter pylori Claritromicina 23S rDNA

81 TUBERCULOSE Identificação de isolados de cultura Identificação directa de produtos biológicos (em desenvolvimento) Espécie Tm M. tuberculosis 63ºC M. kansasii 59ºC M.avium 58ºC M.intracellulare 54ºC M.gordonae 49ºC

82 16S rDNA Gene 16S rDNA – natureza conservada no reino procariota
PCR Universal  uma reacção  amplifica vários agentes Detecção da presença de bactérias em amostras clínicas estéreis

83 16S rDNA Aplicações: LCR, Sangue, produtos biológicos “estéreis”
Problemas: Detecção de bactérias inviáveis Risco de contaminação laboratorial Risco de contaminação na colheita Correlacionar resultados positivos com a clínica

84 16S rDNA Total Nucleic Acid Isolation Kit Bactérias Gram -
Inactivação do DNA exógeno (irradiação UV reagentes/material) Extracção de ácidos nucleicos Bactérias Gram - Bactérias Gram + Micobactérias Lise enzimática / mecânica Magna Pure LC, Roche Total Nucleic Acid Isolation Kit Amplificação Smart Cycler, Cepheid - PCR em Tempo Real Múltiplos controlos negativos (extracção, amplificação)

85 16S rDNA Sensibilidade: 80%; Especificidade: 94.5%
Sensibilidade analítica do método S. aureus  160 UFC/mL E. coli  200 UFC/mL Aplicação a 76 amostras de LCR (Meningite Bacteriana Aguda) Sensibilidade: 80%; Especificidade: 94.5% VPP: 84%; VPN: 92.7% Resultado – POSITIVO/NEGATIVO

86 16S rDNA Espécie Origem PCR em tempo real E. coli S. aureus
ATCC 25922 Pos S. aureus ATCC 25923 E. faecalis ATCC 25212 S. pneumoniae ATCC 6305 P. mirabilis ATCC 12453 E. cloacae ATCC 13047 K. pneumoniae ATCC 13883 P. aeruginosa ATCC 27853 H. influenzae ATCC 49766 N. meningitidis Isolado clínico L. monocytogenes S. epidermidis S.agalactiae M. tuberculosis Leptospira sp

87 16S rDNA Estirpes detectadas por outros autores com os mesmos primers
Acinetobacter calcoaceticus Clostridium perfringens Aeromonas hydrophila Corynebacterium genitalium Alcaligenes faecalis Erysipelothrix rhusiophathiae Bacteroides fragilis Gardnerella vaginalis Campylobacter fetus Lactobacillus acidophilus Campylobacter jejuni Leuconostoc paramesenteroides Eikenella corrodens Micrococcus luteus Mycoplasma genitalium Flavobacterium meningosepticum Legionella pneumophila Mycoplasma hominis Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Peptostreptococcus anaerobius Providencia stuartii Peptostreptococcus magnus Salmonella typhimurium Propionibacterium acnes Serratia marcescens Streptococcus mitis Yersinia enterocolitica Streptococcus sanguis

88 16S rDNA Kits de Extracção MGrade Enzimas LowDNA Desafio:
 sensibilidade sem comprometer a especificidade Kits de Extracção MGrade Enzimas LowDNA Essencial: Resultados positivos  Identificação do produto amplificado Distinguir contaminações de verdadeiros positivos Correlação com clínica  Valor Preditivo Positivo  Sensibilidade


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