Descoberta de novos genes no genoma de Saccharomyces cerevisiae

Apresentação em tema: "Descoberta de novos genes no genoma de Saccharomyces cerevisiae"— Transcrição da apresentação:

1 Descoberta de novos genes no genoma de Saccharomyces cerevisiae
Enio Felipe da Rocha Vinicio Tavares de Melo Costa da Silva

2 S. Cerevisiae Genome Project
Fungos unicelulares Primeiro genoma eucariota completamente sequenciado (1996) DNA cromossômico: 12,07 mb Apenas 3,8% dos ORFs contém introns. Cerca de genes codificam proteínas com mais de cem aminoácidos

3 Falhas na anotação inicial
Não foram levados em conta os ncRNA Os métodos aplicados subestimaram o número de genes. Alguns genes são transcritos em ncRNAs Desde 1997 já sabia-se que existiriam smORFs que não foram anotados originalmente.

4 Homologia

5 Objetivos Análise comparativa do genoma de S. Cerevisiae para identificar novos ORFs não encontrados anteriormente Validar este método para que ele possa ser usado na atualização da anotação de outros genomas já seqüenciados.

6 Metodologia Partir da seqüência genômica original
Remover todos ORFs identificados originalmente Usando o resultado do passo anterior (3,45 mb) encontrar todos os stop-to-stop ORFs com mais de 18 códons. Baseado no número de códons dos genes de E. Coli

7 Metodologia Comparação dos resultados ( possíveis genes) com um banco de dados de seqüências contendo genes de todo o reino fungi mais outros organismos selecionados Cutoff de p < 10-4 Com essa busca foram encontrados possíveis ORFs com homólogos no banco de dados

8 Metodologia A partir desses resultados retirou-se todos os genes que já tinham sido anotados depois de 1997. Descartou-se também os genes que sobrepunham-se com rRNAs, tRNAs, etc. Produto = 558 smORFs em regiões antes consideradas intergênicas Tamanho dos ORFs variam de 18 a 190 códons

9 Metodologia

10 Resultados Escolha de 117 smORFs para validação
Verificação da expressão destes ORFs em organismos Primers construídos para a amplificação de três smORFs e de ACT1. Uso de PCR Sucesso na amplificação destes genes.

11 Polymerase Chain Reaction

12 Resultados Verificação da expressão destes genes
RT-PCR Produto para os quatro ORFs foram encontrados Garantia de que estes smORFs são expressos nas células Ampliação deste estudo para os outros 114 smORFs Achou-se mRNAs para 81 smORFs smORF 68 tinha sido retirado do SGD

13 Resultados Apenas 1 smORF foi encontrado mais de uma vez
Ele está incluído nos smORFs para os quais não foi encontrado produto depois da RT-PCR Possibilidade de read through? A RNA polimerase não se desacopla da fita de DNA e sintetiza RNA mesmo depois do stop códon

14 Resultados Mediu-se o tamanho dos transcritos de smORF2 e smORF31 (Northern analysis) Ambos os ORFs apresentaram tamanho de 460nt Região traduzida = 250 nt Região não-traduzida 5’ = nt Região não-traduzida 3’ = 100 nt Cauda Poli-A = 100 nt Forte indício de que não se trata de read through já que o gene “anterior” a smORF2 está a 1700 nt upstream A transcrição deste gene é originada no seu promotor.

15 Resultados Caracterização de smORF2
A proteína codificada por este gene está presente em muitos organismos, até mesmo humanos Nos humanos este ORF está presente em 2 loci Detecção da proteína codificada Marcação do gene (HA inserido no final do gene) Resultados experimentais confirmam que o gene smORF2 realmente codifica uma proteína produzida smORF2p é essencial para o organismo?

16 Resultados Presença de smORF2 em várias espécies de diferentes reinos

17 Resultados Vetores sem este gene foram incapazes de crescer com temperaturas de 37o C

18 Análise Criação de novo método para a identificação de genes em genomas já seqüenciados Método simples acelerará a anotação destes genomas ORFs que não tenham homólogos em outras espécies (orfãos) não serão encontrados

19 Referências Kessler, M.M., Zeng, Q., Hogan, S., Cook, R., Morales, A.J., Cottarel, G Systematic Discovery of new genes in Saccharomyces cerevisiae genome. Genome Research 13: Andrade, M.A., Daruvar, A., Casari, G., Schneider, R., Termier, M., and Sander, C Characterization of new proteins found by analysis of short open reading frames from the full yeast genome. Yeast 13: 1363–1374. Goffeau, A Four years of post-genomic life with 6000 yeast genes. Federation of European Biochemical Societies 480: Cliften, P.F., Hillier, L.W., Fulton, L., Graves, T., Miner, T., Gish,W.R., Waterston, R.H., and Johnston, M Surveying Saccharomyces genomes to identify functional elements bycomparative DNA sequence analysis. Genome Res. 11: 1175–1186.

20 Referências Johnston, M The yeast genome: on the road to the golden age. Current Opinion in Genetics & Development 10: Kumar, A., Harrison, P.M., Cheung, K.H., Lan, N., Echols, N.,Bertone, P., Miller, P., Gerstein, M.B., and Snyder, M An integrated approach for finding overlooked genes in yeast. Nat.Biotechnol. 20: 58–63. Olivas, W.M., Muhlrad, D., and Parker, R Analysis of the yeast genome: Identification of new noncoding and small ORF-containing RNAs. Nucleic Acids Res. 25: 4619–4625.