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Microscopia de contraste de fase. Contraste: diferença de iluminação entre amostras e os arredores ou o plano de fundo. LUZ absorção Transmissão = luz.

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1 Microscopia de contraste de fase

2 Contraste: diferença de iluminação entre amostras e os arredores ou o plano de fundo. LUZ absorção Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração + reflexão) reflexão fluorescência refração

3 Tipos de contraste de fase Tipos de contraste de fase 1) Positivo: amostra é mais escura do que o plano de fundo; 2) Negativo: amostra é mais clara do que o plano de fundo. Equação Equação I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a). Contraste = (I f - I a ) x 100 I f Microscopia de contraste de fase

4 Tipos de amostra Tipos de amostra 1) Amplitude: alteram a intensidade da luz transmitida. Amostras transparentes coradas causam o mesmo efeito. 2) Fase: não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos comprimentos de onda que a atravessam. Amostra transparente Amostra tipo amplitude Amostra tipo fase Amostra tipo misto (maioria) Microscopia de contraste de fase

5 Contraste em amostra com baixo retardo de fase Contraste em amostra com baixo retardo de fase Microscopia de contraste de fase - Os raios não desviados são retardados cerca de ¼ de l em relação aos raios não desviados; - a diferença de intensidade de luz não é percebida pelo olho humano (não dá contraste). amostra Distância focal condensador Lente do tubo Plano da imagem ocular objetiva Raios não desviados Raios desviados

6 O que o contraste de fase faz? O que o contraste de fase faz? 1) Contraste de fase positivo -Acelera os raios não desviados em ¼ de elevando a diferença de fase total para ½ de ; - a amostra fica escura, circundada por halo claro, sobre um fundo mais claro (menos claro que o halo). Dá contraste. 2) Contraste de fase negativo -Retarda os raios não desviados em ¼ de elevando a diferença de fase total para ½ de ; - a amostra fica clara, circundada por halo escuro, sobre um fundo mais escuro (menos escuro que o halo). Dá contraste. Microscopia de contraste de fase

7 Configuração Configuração objetiva amostra condensador Raios desviados 90º fora de fase Não desviados não desviados + 90º Raios desviados 180º fora de fase Anel de fase Trabalha-se nos planos da imagem conoscópica

8 Microscopia de contraste de fase Configuração Configuração Parte central do anel mais fina que a periferia Contraste positivo Parte central do anel mais fina que a periferia Contraste negativo

9 Microscopia de contraste de fase Dados técnicos Dados técnicos 1) A cessórios obrigatórios: anel de fase para condensador e objetivas com anéis de fase; 2) Acessório extra: filtro verde. Isto porque os o sistema é projetado para funcionar melhor no centro do espectro visível (cor verde).

10 Técnicas e contraste Técnicas e contraste AmostraTécnicaContraste TransparenteCampo claro2-5% CoradaCampo claro25% TransparenteContraste de fase15-20% TransparenteContraste diferencial de interferência15-20% TransparenteCampo escuro60-75% TransparenteFluorescência60-75% Microscopia de contraste de fase

11 Alinhamento dos anéis de fase Alinhamento dos anéis de fase - Usar telescópio de fase (o mesmo usado para ver a imagem conoscópica) para ver os anéis pela ocular; - Alinhar os anel do condensador movimentando os parafuso de ajuste no condensador próprio para a técnica; - Sem alinhamento a técnica não funciona. Anéis não alinhados Anéis alinhados Microscopia de contraste de fase

12 Indicações Indicações - Amostras vivas ou fixadas não coradas; - Melhorar contraste para visualização de detalhes em amostras coradas (ex.: estriações transversais de músculos)

13 Microscopia de contraste de fase Limitações Limitações - os halos podem obscurecer os detalhes que circundam a amostra; - os anéis de fase reduzem a resolução da objetiva; - não é adequada para amostras espessas.

14 Microscopia de contraste de fase Contraste de fase positivo Contraste de fase negativo Imagens Imagens - Células de ovário de hamster

15 Osso de dinossauro fossilizado com quartzo no canal de Havers Preparo por desgaste Contraste de fase Osso compacto humano Preparo por desgaste

16 Contraste de fase + coloração Aterosclerose (placa de colesterol na parede da artéria) Contraste de fase + coloração Pneumonia brônquica

17 Contraste de fase + HE Língua humana Contraste de fase + HE Cartilagem hialina

18 Contraste de fase Pólen de plantasc Contraste de fase + HE Neurônio multipolar


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